用户文章丨《INT J BIOL MACROMOL》P300助力盛京医院团队开发用于内镜粘膜下剥离术的新型可注射温敏水凝胶

2024-07-17 09:05:08 28阅读次数

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2024年6月18日，中国医科大学附属盛京医院孙思予、孙广炜、刘洋团队在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊在线发表了题为“Injectable chitosan-polyvinylpyrrolidone composite thermosensitive hydrogels with sustained submucosal lifting for endoscopic submucosal dissection”的论文。该团队前期开发了一种高pH壳聚糖溶液（HpHCS），证实此溶液去质子化程度较高，能够显著提高温敏成胶的速度（European Polymer Journal. 2023, 196, 112229.）。在此基础上，本研究进一步构建了一种粘度更低、凝胶完整度和稳定性更好的新型可注射复合温敏水凝胶系统——高pH壳聚糖-聚乙烯吡咯烷酮-β-甘油磷酸钠（HpHCS-PVP-GP），通过响应面方法研究了HpHCS、PVP及GP浓度对凝胶化时间的影响，并在体内外实验中验证了该凝胶具有良好的粘膜下抬升性能和促进ESD创面愈合的潜力。

核心产品——HOOKE P300 pro激光共聚焦拉曼光谱仪有幸为本研究中新型HpHCS-PVP-GP凝胶的构建机制分析提供了有力研究工具。

一、研究背景

早期胃肠道病变通常指的是胃肠道的表层粘膜或粘膜下层出现的病变，这些病变如果及早发现和治疗，通常预后较好。内镜粘膜下剥离术(ESD)是一种常用于治疗这些早期病变的微创手术，手术过程通常采用粘膜下注射来抬高病变区域，使得在粘膜和固有肌层之间创造足够的操作空间。理想的粘膜下注射剂应易于获得、成本低、无害、易于制备、可注射，并能持续抬高病变。然而，目前临床常用的生理盐水、透明质酸溶液等注射液还存在一些问题，如注射后容易扩散及需要重复注射等。因此，本研究在前期高pH壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶（HpHCS-GP）的研究基础上，进一步构建了一种粘度低、凝胶速度快、稳定性好、完整性高的可注射温敏型HpHCS-PVP-GP水凝胶，该凝胶可满足临床ESD手术中易注射、易操作、病灶抬升效果好、持续时间久等需求。

二、实验方法

该团队前期开发了一种高pH壳聚糖溶液，此溶液与β-甘油磷酸钠所形成的HpHCS-GP温敏水凝胶虽然具备快速凝胶化和稳定性好等特点，但其无法满足ESD手术中易注射的要求，即HpHCS-GP的低温成胶溶液的粘度较高，导致注射压力较大，难以通过ESD针进行注射。针对此关键问题，本研究通过降低HpHCS浓度来降低注射液粘度，并通过添加PVP增强低浓度HpHCS-GP凝胶的稳定性和完整性，从而构建了可应用于ESD术的可注射温敏型黏膜下注射液。本研究也通过拉曼光谱及等温滴定微量热等方法确定了HpHCS-PVP-GP凝胶的构建机制，并利用响应面方法建立数学模型评估了HpHCS、GP和PVP浓度对凝胶时间的协同影响，最后本研究通过一系列的体内外细胞、组织及体内动物实验阐明了该温敏凝胶的安全性与在ESD术中的应用效果。

图1 HpHCS-PVP-GP温敏水凝胶作为一种新型粘膜下注射液在ESD手术中的应用潜力

A为含PVP和不含PVP的温敏性水凝胶的差异；B为含亚甲基蓝的HpHCS-PVP-GP水凝胶的可注射性和凝胶能力；C为HpHCS-PVP-GP温敏水凝胶作为ESD黏膜下注射液的应用示意图

三、结果

1.HpHCS-GP的缺陷

研究团队前期开发的HpHCS-GP温敏水凝胶，原理是通过添加过量壳聚糖(CS)使其氨基去质子化程度提高，进而提高CS溶液的pH值，得到HpHCS溶液，在低温下添加GP溶液后，形成HpHCS-GP低温成胶溶液，温度提高至37℃时可形成稳定的HpHCS-GP水凝胶。本研究发现HpHCS粘度过高，导致了HpHCS-GP低温成胶溶液难以通过ESD针进行注射。因此，本研究通过降低HpHCS溶液浓度的方式降低了其粘度。HpHCS溶液浓度从2.7%依次降低至0.338%(图2C)，各浓度的HpHCS溶液都呈现透明状态，在相同GP浓度下，制备了对应不同浓度的HpHCS-GP水凝胶低温成胶溶液，结果发现，低浓度HpHCS-GP溶液的浑浊度逐步增加(图2D)，凝胶化能力也逐步降低，甚至在0.338%浓度下丧失凝胶能力(图2E)，因此选择了稀释至0.675% (w/v)的浓度作为后续HpHCS-PVP-GP凝胶的制备浓度。

图2 不同浓度HpHCS溶液及HpHCS-GP的凝胶效果

C为逐步稀释的HpHCS溶液透明度；D为HpHCS-GP低温成胶溶液的透明度；E为HpHCS-GP溶液在37℃下的凝胶效果。

2. HpHCS-PVP-GP凝胶的开发

在上述过程中，随着HpHCS浓度的降低，HpHCS-GP的低温成胶溶液的pH值逐渐增大，增加了CS氨基的去质子化程度和链间的静电吸引，导致了疏水相互作用增强，产生了小的CS沉淀，降低了其稳定性。此外，CS沉淀的存在延缓了凝胶化过程，显著降低了水凝胶的完整性。已有研究发现CS的羟基能够与PVP的羰基形成氢键，因此本研究通过加入PVP来解决HpHCS-GP低温成胶溶液稳定性低及成胶能力差的问题。研究显示，加入顺序为HpHCS+GP+PVP会影响低温成胶溶液的稳定性和凝胶完整度，导致37℃凝胶化能力明显降低，而加入顺序为HpHCS+PVP+GP可以保证低温成胶溶液的透明度(没有沉淀)，并且能在37℃下形成完整良好的水凝胶(图3)。

图3 PVP加入顺序对HpHCS-GP低温成胶溶液透明度和凝胶能力的影响

B为低温下后加PVP与先加PVP的HpHCS-GP低温成胶溶液透明度的差异；C为37℃下后加与先加PVP对HpHCS-GP温敏凝胶能力的影响。

3. HpHCS-PVP-GP凝胶的作用机制

为探究PVP提高HpHCS-GP低温成胶溶液稳定性的作用机制，本研究中先对HpHCS溶液，PVP溶液，HpHCS-PVP混合溶液进行了拉曼光谱检测，结果发现，代表PVP羰基的1668 cm^-1峰位在HpHCS-PVP中红移至1660cm^-1，代表HpHCS中羟基的3432cm^-1峰位在HpHCS-PVP中蓝移至3442cm^-1(图4A)。同时，两个峰的峰强在HpHCS-PVP中均有所下降，这表明在HpHCS-PVP基团中，PVP的羰基与HpHCS的羟基之间形成了氢键。三者的拉曼光谱经t-SEN分析的预测无法区分PVP和HpHCS-PVP(图4B)，但经过支持向量机(SVM)的分类，三者之间的预测准确率为100%且ROC曲线证明该模型可靠(图4CD)，说明三者在拉曼指纹区域的差别仍然较大。

图4 HpHCS-PVP的拉曼光谱分析

A为HpHCS、PVP、HpHCS-PVP三者的拉曼光谱；B为t-SNE算法对三者光谱的聚类；C为SVM算法对三者光谱的预测；D为SVM模型的ROC曲线

接着，本研究进一步探究了造成HpHCS-PVP-GP 凝胶较HpHCS-GP 凝胶完整度提高的内在机制，分别对HpHCS、GP、PVP、HpHCS-GP凝胶、HpHCS-PVP-GP凝胶都进行了拉曼检测。结果发现，在HpHCS-PVP-GP凝胶中观察到了与上述HpHCS-PVP相似的现象，代表PVP羰基的1668cm^-1峰位在HpHCS-PVP-GP凝胶中红移至了1658cm^-1，且与3432cm^-1峰位处的羟基峰峰强都有所降低。这个结果表示PVP与HpHCS之间的氢键能够提高37℃下HpHCS-PVP-GP凝胶的完整性。

图5 HpHCS-PVP-GP水凝胶的拉曼光谱分析

A为同浓度下PVP溶液、HpHCS溶液、GP溶液、HpHCS-GP凝胶、HpHCS-PVP-GP凝胶的拉曼光谱；B为t-SNE算法对5种溶液/凝胶的聚类；C为SVM模型对5种溶液/凝胶的预测准确率；D为SVM算法的ROC曲线

另外，本研究除了通过拉曼光谱探究HpHCS-PVP-GP凝胶的内部作用机制，还通过等温滴定微量热分析(ITC)方法进一步验证了PVP与HpHCS之间发生氢键作用，而几乎不与GP发生反应。

4. HpHCS-PVP-GP凝胶的体内外性能

本研究进一步通过响应面方法(RSM) 证实了HpHCS、GP和PVP浓度对37℃下HpHCS-PVP-GP凝胶化的协同影响，确认了不同浓度的PVP对HpHCS-PVP-GP水凝胶注射压力和细胞毒性的差异，并通过体外猪食管组织注射模型确认了5%PVP为较合适的浓度，该浓度下HpHCS-PVP-GP凝胶具有更致密的凝胶结构和更高的凝胶压缩强度，体外黏膜抬举维持能力最佳。最后，巴马小型猪食管ESD实验明确了HpHCS-PVP-GP温敏水凝胶具有良好的体内粘膜下抬升性能，并且能够促进ESD手术后的创面愈合。

四、结论

本研究成功设计、制备了一种新型的可注射壳聚糖-聚乙烯吡咯烷酮-β-甘油磷酸钠复合温敏水凝胶(HpHCS-PVP-GP)，用于内镜下粘膜剥离术(ESD)中的粘膜下抬升。在本研究中确定了HpHCS、GP和PVP的最佳浓度配比，揭示了HpHCS-PVP-GP的内部作用机制，通过体内外实验证实了该水凝胶具有优于传统粘膜下注射剂的低注射压力、高抬升高度、持久黏膜提升能力等优点。总体而言，HpHCS-PVP-GP水凝胶的开发为温敏水凝胶在ESD应用中的优化设计提供了新思路。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813024039709

五、辰英价值

该研究采用的HOOKE P300 pro是研制的一款高端科研级激光共聚焦拉曼光谱仪。在本文中，HOOKE P300 pro对HpHCS-PVP-GP凝胶及其各成分的拉曼检测，揭示了PVP与HpHCS之间通过氢键作用改善水凝胶性能的分子机制，配套搭载的HOOKE IntP智能分析软件对该凝胶及其各成分的拉曼光谱进行了t-SNE聚类分析和SVM分类预测。这些结果为水凝胶的优化提供了科学依据，同时也体现了HOOKE P300 pro在材料学与生物医学领域的应用潜力，为开发新型生物材料、探究材料间分子互作提供了新的思路。

六、研究团队介绍

孙思予-中国医科大学副校长、教育部消化内镜微创诊疗技术工程研究中心主任、盛京医院消化学科带头人，教育部“长江学者”特聘教授

研究领域：消化内镜和内镜超声介入治疗。国家百千万人才工程人选、有突出贡献中青年专家、全国先进工作者、全国五一劳动奖章获得者、全国优秀科技工作者、辽宁省特聘教授、国务院政府特殊津贴获得者、卫生部有突出贡献中青年专家、沈阳市十大杰出青年、国家科技进步二等奖第一完成人、国际著名期刊《Endoscopic Ultrasound》（《超声内镜（英文版）》）创办人及总编辑、国家卫生健康委罕见病诊疗与保障专家委员会副主任委员、中华医学会消化内镜学分会副主任委员、中国医师协会消化医师分会副会长、国际超声内镜学会副主席兼秘书长、日本消化内镜学会会士、第十四届全国人大代表、辽宁省第十四届人民代表大会代表、辽宁省第十四届人民代表大会教育科学文化卫生委员会委员、中国民主同盟第十二届中央委员会委员、民盟辽宁省委员会副主任委员、民盟沈阳市委副主委。

孙广炜-中国医科大学附属盛京医院细胞治疗创新工程技术研究中心主任，研究员

目前开展的工作包括三个方面：iPS疾病模型构建及应用、肿瘤类器官构建及应用、干细胞体外分化诱导与组织重建。在日研究工作获多项科研经费支持，其中包括：2003年至2005年获得日本学术振兴会(JSPS)特别研究员经费，2006年至2010年以项目负责人身份连续两次获得日本文部科学省科研经费。除此之外，还参与完成多项日本文部科学省科研课题。回国后，作为项目负责人主持国家自然科学基金、国家科技重大专项、省市级科研项目、大连化物所“百人计划”等项目，并承担多项企业委托研发项目。共发表论著三篇，SCI收录论文五十余篇(第一作者10篇，通讯作者20篇)。申请国际专利1项，国内专利57项，授权18项，软件著作权1项。

刘洋-中国医科大学附属盛京医院细胞治疗创新工程技术研究中心研究员

目前主要研究方向为用于消化内镜诊疗的新型仿生材料、技术的研发与应用。作为项目负责人主持国家自然科学基金委医学部面上项目1项、生命科学部面上项目2项、化学科学部青年基金项目1项，主持辽宁省基础研究计划联合项目1项；作为骨干参加美国NSF、NIH项目、中科院战略性先导专项、国家科技重大专项、973重大项目等项目。至今共发表SCI收录论文40余篇，包括J Am Chem Soc、Biomaterials、Talanta、Int J Biol Macromol、Eur Polym J、Stem Cells Int、J Biomed Mater Res A等；申请、授权中国发明专利50余件。

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