如何利用可视化单细胞分选技术高效开展“功能靶向”宏基因组研究？

2024-06-28 10:00:10 79阅读次数

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传统宏基因组学技术已经能够揭示环境微生物群落的结构和功能潜力，但在面对大量非目标序列时，其局限性逐渐显现。为了更精确地研究特定基因或基因组区域，功能靶向宏基因组技术应运而生，为科研工作者提供了新的工具。

靶向宏基因组方法的一种常见应用是通过16S rRNA基因来研究微生物群落的组成。16S rRNA基因是微生物中高度保守的基因，它在不同的微生物中具有一定的变异性，可以用来区分不同的微生物种类。但这种靶向宏基因组存在的一个问题是，所有的探针和基因仅针对已知基因，而目前对微生物基因的探究（特别是未培养微生物的基因）仍存在很多未知的基因无法被检测功能。

图1 传统宏基因组（右）与靶向宏基因组（左）流程示意图

Hilt EE, Ferrieri P. Next Generation and Other Sequencing Technologies in Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases. Genes (Basel). 2022;13(9):1566. Published 2022 Aug 31. doi:10.3390/genes13091566

“功能靶向宏基因组”解决方案

基于上述现状，我们提出了“功能靶向宏基因组”的解决方案。采用功能筛选+检测的方法代替了靶向宏基因组中功能基因进行PCR的过程。通过对细菌群落进行功能筛选，对具备某种功能的细菌进行形态/荧光/同位素的标记，并采用HOOKE系列的拉曼光谱和荧光成像产品进行相关检测，完成“功能筛选”的过程，进而通过单细胞分选+MDA扩增的方法对筛选的细胞进行分离和宏基因组测序。

该方法融合了靶向宏基因组筛选功能基因的作用，同时又兼顾传统宏基因组物种组成功能，除此之外能够在靶向宏基因组的基础上拓展新的功能基因，且操作简单，成本并不高昂。

方法效果比较

表1 传统宏基因组、靶向宏基因组与功能靶向宏基因组比较

功能靶向宏基因组与传统靶向宏基因组的最大差异在于，功能筛选面向具有功能的微生物，而非仅限于功能基因。过去的研究表示具备功能基因的细菌在对应功能上可能并不具备优势，而能够实现检测基因表达的宏转录组在复杂微生物环境中无法适用，这使得开发一种功能优势微生物筛选方法成为刚需。基于HOOKE系列仪器的功能靶向宏基因组在解决筛选功能优势微生物的同时，能够将功能优势菌进行分离和全基因组扩增，使得分离的功能优势菌能够符合宏基因组检测的上样标准，实现功能表型+功能基因的统一。

关联阅读：

功能菌筛选技术方案(二)丨微生物多维表型检测与可视化精准分选平台下的表型靶向MiNi宏基因测序

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功能靶向宏基因组方案流程

图2 功能靶向宏基因组流程示意图

该流程根据不同的筛选方法主要分为拉曼筛选和成像筛选。

拉曼筛选方法主要通过同位素（SIP）标记功能菌，将同位素底物与微生物共同培养，根据微生物代谢底物的速度不同，配合PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪，在拉曼识别同位素标记菌群后完成功能菌的分离，后续采用MDA全基因组扩增并进行宏基因组检测。

成像筛选主要通过荧光标记或细菌特殊形态，对功能优势菌进行可视化的标记后，配合PRECI SCS-F可视化荧光分选仪，完成分离-扩增-宏基因组过程。

功能靶向宏基因组技术应用问题

问

功能靶向宏基因组方案有哪些适用条件？

该技术主要面向微生物，提供细/真菌群落中功能优势菌的功能表型与功能基因统一的解决方案，适用范围较广，需要满足的唯一条件即功能标记，功能优势菌需要在功能基因/代谢/形态上有别于其他非功能优势菌。

问

常用的功能标记技术有哪些？

常见的功能标记技术包括荧光标记与同位素标记，荧光标记可以采用普通的荧光染色标记，或者荧光原位杂交（FISH）、荧光寿命成像（FLIM）等；同位素标记常用的有2H、13C、15N等。具体的标记及文献参考可以参阅：

1.FISH标记

FISH联用技术揭开微生物的神秘面纱丨FISH与Raman、LIFT技术联用方案

2.SIP标记

微生物研究的新视角丨SIP-稳定同位素技术与拉曼光谱的联合应用

问

功能靶向宏基因组在宏基因组测序方面有什么要求吗？

一般来说，功能靶向宏基因组技术在宏基因组测序方面与常规宏基因组测序并无差别。分离的功能优势菌在扩增后可以达到宏基因组测序的上样要求。另一方面，根据功能优势菌的分选数量，在宏基因组测序深度上可以视情况减少，节省成本。

案例分享

1. 《Active antibiotic resistome in soils unraveled by single-cell isotope probing and targeted metagenomics》

链接：《PNAS》丨单细胞拉曼结合靶向宏基因组揭示土壤活性抗生素耐药组

该文章通过重水标记土壤耐药活性菌，量化土壤耐药水平，结合单细胞分选和宏基因组测序揭示了土壤高活性耐药菌基因组成以及土壤中耐药基因水平转移。

2. 《Integrated identification of growth pattern and taxon of bacterium in gut microbiota via confocal fluorescence imaging‐oriented single‐cell sequencing》

链接：《mLife》丨基于共聚焦荧光成像的单细胞分选测序技术揭示肠道菌群中细菌的分裂模式及种属分类

该文章通过D型氨基酸荧光探针对小鼠肠道微生物进行了荧光标记，并结合单细胞分选与全基因组测序，实现了同时获取肠道微生物组生长分裂表型与基因型。

3.《Mini-metagenome analysis of psychrophilic electroactive biofilms based on single cell sorting》

链接：《SCI TOTAL ENVIRON》| 基于HOOKE单细胞分选平台的嗜冷电活性微生物的mini-metagenome分析研究

该文章前期通过16s扩增子测序确定了嗜冷电活性微生物群落中的主要优势物种为地杆菌，后根据拉曼光谱聚类及地杆菌形态，结合单细胞分选与mini宏基因组确定了参与细胞外电子转移的代谢基因。

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