5个步骤掌握FISH技术：高效探索微生物世界

2024-04-2318

荧光原位杂交技术（FISH）是一种强大的分子生物学工具，它允许研究者在保持细胞形态完整的条件下，检测和定位特定微生物群落中的核酸序列。这项技术通过使用带有荧光标签的特异性探针，使得目标微生物在复杂的环境样本中得以可视化。FISH技术的应用范围广泛，包括但不限于生物被膜研究、环境微生物组成分析、以及微生物代谢机制的探究。

与传统的分离培养方法相比，FISH技术能够在原位条件下进行，避免了因培养条件改变而导致的微生物生理状态和代谢特性的变化，从而更真实地反映微生物在自然环境中的状态。此外，FISH技术还可以与其他技术如拉曼光谱（Raman）和激光诱导向前转移（LIFT）技术联用，进一步提升微生物研究的深度和广度。

FISH技术的实验方法

第一步：准备目标基因对应的探针

在进行FISH实验之前，首先需要设计并合成与目标微生物的特定基因序列互补的探针。这些探针通常带有荧光标签，以便在显微镜下进行可视化。

第二步：探针变性

对于双链DNA探针，需要在实验前进行变性处理，将其转换为单链形式以便与目标序列进行杂交。这一过程通常在70℃-80℃的条件下进行约10分钟，随后迅速冷却以防止探针重新形成双链。

第三步：样品制备

样品的固定是FISH实验中的关键步骤。通常使用4%的多聚甲醛作为固定液，以保持细胞的形态和结构完整性。固定后的样品需要经过一系列的脱水步骤，通常使用50%、80%和100%的乙醇进行处理。

第四步：杂交

在样品脱水后，滴加含探针的杂交液，并在湿盒中进行恒温杂交，时间一般为1-3小时，温度根据探针的设计选择在37-46℃之间。如果需要进行预杂交，可以先使用不含探针的杂交液进行处理，以减少非特异性结合。

第五步：洗脱

杂交完成后，使用预热的清洗液进行漂洗，以去除非特异性杂交的探针。随后使用超纯水清洗并吸干样品，然后进行荧光显微镜下的观察。