【文献速递】用于监测AD模型中内源性过氧亚硝基阴离子的荧光探针

过氧亚硝酸根（ONOO^-）是一种具有强氧化和硝化能力的活性氧和氮物种（RONS），在生物体系中通过一种快速的扩散控制反应形成，该反应涉及两种自由基——一氧化氮（?NO）和超氧阴离子（O₂^-），且不需要酶催化。在正常浓度下，ONOO^- 能够维持氧化还原平衡，并作为信号分子通过硝化酪氨酸残基来调节神经信号传导途径。然而，ONOO^- 的过度产生可能导致阿尔茨海默病（AD）中的氧化应激和神经退行性变，继而引起脂质、核酸、酶和蛋白质的结构和功能变化，这被认为是早期AD诊断的潜在生物标记物。

当前，已有多种分析方法被用于检测ONOO^-，包括电子自旋共振、比色法、电化学、液相色谱-质谱和荧光分析等。其中，荧光分析检测方法因其特异性、灵敏度、非侵入性和实时监测的优势而受到广泛关注，被认为是生物系统中感测和成像ONOO^- 的理想选择。

迄今为止，许多 ONOO^- 荧光探针都是依靠不同的反应模式开发出来的，例如硫化物的氧化、硼酸或硼酸酯的氧化、C-C双键的断裂、氧化性N-脱芳基化等，但ONOO^- 荧光探针在实际应用中仍存在一些挑战：（1）ONOO^- 与其质子化形式ONOOH（pKa = 6.8）处于平衡状态，在生物体系中半衰期极短（约10毫秒），需要探针具有超快的响应速度以满足实时监测的需求；（2）探针必须具有良好的水溶性和低毒性，才适合在复杂的生物体系中应用；（3）探针需要对ONOO^- 具有高度选择性，以避免其他ROS/RNS的干扰，尤其是与ONOO^-反应性类似的HO；（4）探针应具有大的斯托克斯位移和长波长发射的特点，以满足AD模型中高分辨率和深层成像的需求；（5）在AD大脑中成像ONOO^-需要探针能够穿透血脑屏障（BBB）。

在本研究中，作者设计并合成了两种新型荧光探针NBD-Y和NBD-I，它们利用ONOO^- 氧化断裂C-N单键的能力来感测和成像体外和体内的ONOO^-。通过对光物理性质的系统研究，证明NBD-Y和NBD-I具有高灵敏度（检测限分别为11和45纳摩尔）、高水溶性（DMSO/PBS = 1:199, v/v）、优异的选择性和对ONOO^- 的快速响应（3秒内）。其中，NBD-Y成功在活细胞中可视化ONOO^-，具有良好的细胞膜渗透性和低细胞毒性。此外，NBD-Y还可以用于成像AD大脑中的内源性过氧亚硝酸根，具有良好的BBB穿透性。这些结果不仅表明NBD-Y作为监测过氧亚硝酸根的敏感和可靠探针具有潜力，还可能指导设计用于多个AD模型中ONOO^- 的新型近红外、双光子和比率荧光探针。

文中应用了生物科技有限公司AniView多模式动物活体成像系统分别拍摄了小鼠ONOO^-活体水平和器官水平的荧光成像。结果显示，WT小鼠脑内荧光在0 ~ 1h ( Fmax / F0 = 3.89)内显著增加，2 ~ 4h内保持稳定。相比之下，APP/PS1小鼠组仅观察到微弱的荧光增强( Fmax / F0 = 1.33 , Fmax和F0分别代表3h和0h时小鼠脑内的荧光强度)。前面体外实验证实AD组和WT组荧光强度的差异主要是由于探针与被激发的ONOO^-之间的反应。三组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中几乎观察不到荧光，但在其大脑中检测到明显的荧光变化。这些器官的离体成像结果表明，WT组和姜黄素（CUR）药物处理组的大脑中的荧光强度远高于AD组，证明探针可以穿过血脑屏障并在大脑中检测到ONOO^-。这些结果证明ONOO^-的过度表达是阿尔茨海默病的明显标志，并且NBD-Y可以有效地检测大脑中ONOO^-的表达水平。