永诺数字PCR精准定值核酸质控品，助力优良质控品创造
2024-06-07119
新型冠状病毒Omicron I1566V突变位点MS2噬菌体病毒样颗粒的构建
[1]杨静远,李永鑫,史茜,等.新型冠状病毒Omicron I1566V突变位点MS2噬菌体病毒样颗粒的构建[J].
检验医学与临床,2024,21(08):1030-1034.
众所周知，稳定、可靠的质控品对于RT-PCR检测室内质量控制十分重要，目前重组质粒常作为RT-PCR检测中的质控品，但存在不能模拟核酸提取及反转录过程、易造成实验室污染等缺点。因此，使用噬菌体或病毒的蛋白质外壳来包裹靶序列制备成病毒样颗粒就能够弥补上述缺点。新型冠状病毒（SARS-CoV-2)的Omicron变异株具有极强的传染性和免疫逃逸能力，在全球的流行周期已长达22个月。基因测序技术是鉴定SARS-CoV-2基因分型的金标准，但由于该技术检测设备昂贵、操作难度大、生物信息分析复杂、检测周期长等原因，在SARS-CoV-2变异株检测中受到极大限制。为此，研究者们不断尝试采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR)、等温扩增技术和熔解曲线等方法在常规PCR实验室完成对SARS-CoV-2变异株的检测。本课题组前期在常规PCR实验室构建了基于分子信标探针技术快速检测OmicronI1566V突变位点的RT-PCR检测体系，为确保该体系的检测质量，急需可靠的质控品用于每检测批的室内质量控制。MS2噬菌体的衣壳蛋白(CP)可包装外源核酸制备成病毒样颗粒，能够模拟从核酸提取到PCR检测质量控制的全过程[8]。因此，本研究基于MS2噬菌体构建了包含Omicron I1566V突变位点的病毒样颗粒，旨在用于已构建的OmicronI1566V突变位点的RT-PCR检测体系的质量控制。（1）序列选取与合成参考GenBank数据库中1.3.1MS2噬菌体序列（GenBank：MK213795.1）合成 MS2噬菌体CP和成熟蛋白（A蛋白）基因（1692bp），并在CP基因中插入6×His标签，序列两边分别加入酶切位点BamHI和HindⅢ。在Outbreak数据库(https://outbreak.info/）比对筛选出Omicron突变频率高且特异性好的I1566V突变位点（图1），参考GenBank数据库中Omicron变异株序列（GenBank：OR472660.1），合成含有Omicron的高频特异突变位点I1566V的序列（184bp），序列两边分别加入酶切位点BglⅡ和KpnI，委托生工生物工程（上海)股份有限公司合成上述2条序列。（2） 重组载体构建 以BamH I和NotI分别1.3.2双酶切质粒pACYCDuet-1和CP、A蛋白基因序列，回收、连接、转化到大肠埃希菌DH5a感受态细胞中。提取质粒，通过双酶切和测序进行鉴定，鉴定正确的重组载体命名为pACYCDuet-MS2。以BglⅡ和KpnI分别双酶切重组载体pACYCDuet-MS2和O-micron突变序列，回收、连接、转化到大肠埃希菌DH5a感受态细胞中。提取质粒，通过双酶切和测序进行鉴定，鉴定正确的重组载体命名为pACYCDuet-MS2-O。（3） 重组蛋白的表达与纯化 将重组载体pACY-CDuet-MS2-O转化到表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆，37℃培养至A6oomm值为0.5～0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为0.3mmol/L,25℃振荡诱导表达14h。8000r/min离心5min收集菌体，按照菌体湿重1g：20mL比例加入TBS缓冲液(pH=7.4)重悬后超声破碎菌体，将破碎后的标本以12000r/min离心10min，将获得的上清液加入NI柱中，分别取10pL洗脱标本用于SDS-PAGE分析。（4） 重组病毒样颗粒的鉴定 取纯化后的标本，在2%磷钨酸复染，100kV加速电压条件下，通过透射电子显微镜（JEM-1200EX)观察颗粒粒径和均匀程度。（5） 重组病毒样颗粒的定量 按照MicroDrop-100微滴式数字PCR仪（广州科技有限公司）标准实验流程，用表1中的引物对稀释的病毒样颗粒进行3次重复性检测来对标本进行定量。（6） 重组病毒样颗粒的稳定性试验 取纯化后的病毒样颗粒，每管500pL，1份4℃放置，剩余4份冻存至一20℃冰箱中，分别在第1、5、10、15天将1份假病毒取出放置在37℃中，然后在第20天将5份假病毒同时进行标本裂解和反转录，利用表1中的引物和探针进行RT-PCR，比较其Ct值变化。（1）重组载体构建所有合成序列均经过测序验证后进行后续试验，重组载体pACYCDuet-MS2-O经酶切鉴定（图2），片段大小与预期一致（1876bp），经测序鉴定MS2噬菌体CP和A蛋白基因序列与I1566V突变序列均正确。
（2）重组蛋白的表达与纯化重组载体pACYCDu-et-MS2-O在表达菌株BL21（DE3)经过IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析结果显示，A蛋白（44X103）、CP（14×103）均成功表达。
（3）重组病毒样颗粒的鉴定将目的蛋白稀释后染色，通过透射电镜观察粒径，目的蛋白在体外自组装形成了大小均匀的病毒样颗粒，直径为23~28nm，符合MS2噬菌体直径大小。
（4）重组病毒样颗粒的定量将纯化后的标本稀释到合适的浓度后进行数字PCR定值，经换算后病毒样颗粒的浓度为8.2×1011copy/mL。
（5）重组病毒样颗粒的稳定性试验在37℃条件下，其Ct值随着放置时间延长逐渐升高，但与4℃条件下的Ct值比较差异较小。制备的病毒样颗粒在37℃条件下可储存20d以上，具有良好的热稳定性。
目前，SARS-CoV-2在全球范围内流行，依然对人类健康造成极大的威胁，如何快速对新发变异株进行监测始终是公共卫生领域所面临的挑战，当前基因测序技术从递交标本到数据发布存在严重的变异监测滞后性。基于分子信标技术，通过识别I1566V位点快速检测Omicron的RT-PCR反应体系，并且制备了该技术配套的变异株质控品，永诺医疗数字PCR设备对质控品精准定值，保证了在常规PCR实验室内对Omicron检测结果的可靠性。总之，该质控品制备的方法具有通用性，使用该方法快速构建的RNA病毒质控品，在面对大规模的突发公共卫生事件时能够快速提供高质量的阳性对照，能够为临床患者救治及公共卫生政策的制定提供强有力的支持。
永诺生物创立于2010年，一直致力于开发数字PCR为主的仪器及应用试剂，并提供相关配套服务，自主研发的数字PCR系统打破了国外技术垄断，为基因精准分析提供强大工具，推出的系列应用试剂得到了广泛认可。公司规模不断扩大，现占地近6000平方米，其中3000平方米为GMP认证厂房，拥有150余人的专业团队。
自成立以来，公司已申请国家专利50多项，获得授权36项，计算机软件著作权8项，广东省名优高新技术产品2项。凭借强大的研发实力和创新能力，成功入选大湾区生物科技创新企业50强、国家高新技术企业、广州市科技创新小巨人企业、广东省高新技术企业培育库入库企业、广州市企业研发机构等荣誉。2023年，更是荣登首届广州百家新税企业“锐100”名单。
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