一步法生物制备临床尺寸软骨组织的原位球形分区水凝胶

与传统的2D 细胞培养技术相比，3D 细胞球体提供了更多的仿生微环境， 在许多组织工程应用中已被证明是有价值的。尽管3D 细胞培养具有受益  效应，但目前球体形成方法的可扩展性有限，对球体组织工程的临床翻译 提出了挑战。虽然Z近采用的液滴微流体可以提供一个连续的生产过程， 但使用油和表面活性剂，通常低通量，以及额外的生物制造步骤的要求阻 碍了球体培养的临床翻译。在这里，使用清洁(例如，无油和无表面活性  剂) ，超高通量(例如，8.5 mL min-1,10000个球体 s-1) ，单步空气微流控  生物制造球体形成区室化水凝胶。这种新技术可以可靠地生产一维纤维， 二维平面和三维体积划分的水凝胶构造，其中每一个都允许空心球形成隔 室的明显(一)各向同性取向。在喷墨生物打印分区水凝胶中产生的球体在 成软骨行为方面优于2D 细胞培养物。此外，细胞球体可以从划分的水凝  胶中获得，并用于以自下而上的方式构建形状稳定的厘米大小的无生物材 料的活组织。因此，预计在空气中微流体生产的球形分区水凝胶可以促进 生产和使用的细胞球体的各种生物医学应用。

1. 引言

2D 体外细胞培养历来是组织工程领域的  黄金标准，其目的是修复、再生或替换受 损的活组织。然而，传统的2D 细胞培养  环境不像它们在体内的天然对应物，因此 对细胞行为产生不利影响。3D 细胞培养  , 如细胞球体或类器官已经允许一种更加 仿生的方法来进行细胞培养。[6-8]已经广 泛报道，仿生3D 球体培养的细胞在用于  组织工程时优于2D 培养的细胞[9-13] ，并且可以促进更可靠的药物靶标发现，并 使得具有改进功能的宏观组织构建体的工 程。例如，载有干细胞球体的生物墨水的 3D 打印改善了生物制品构建体的功能行  为(例如，成软骨分化和软骨基质沉积) 。 虽然有希望，但是诸如球体培养等3D 培  养技术的生产方法阻碍了它们的临床翻译 , 这些生产方法通常是批处理过程，拥有 属性较低。

这些批量生产技术如微孔[9,10,12,21-24]和悬挂滴[13,2 5-27]需要多个复杂和耗时的步骤，只能提供有限的球体产量 。尽管特定的生物反应器方法可以提高产量，但它们仍然局  限于批处理过程，与微电池和悬挂液滴等隔离技术相比，这  些批处理过程通常对球体直径的控制水平较低。 [28]虽然这  可能足以进行小型实验室规模的实验，但仍然需要具有高生  产率和高单分散性的强大的单步生物制造技术来促进临床尺  寸组织的球体技术的临床翻译。 [29,30]微流体防火分区Z近被研究用于将球体生产从批量生产过 程发展为连续生产过程。在中空生物材料隔室中的细胞微流  体封装允许细胞球形成微生物反应器的控制连续生产，这提  供了比传统的批处理工艺更高的生产率。 [31-3提供了比传统 的批处理工艺更高的生产率。 [31-39]

然而， 由于各种原因，传统的片上微流控液滴发生器的设计阻 碍了微流控液滴产生的球体在临床上的广泛应用。首先，传统 的芯片上微流体需要使用不可混溶的液体来形成液滴，这通常 需要使用已知具有潜在危害并且常常与临床应用不相容的油和 表面活性剂。因此，产生的球体形成隔室需要大量清洗， 以试 图在培养/使用之前除去油和表面活性剂，这与耗时的手工过  程有关，这对细胞活力有不利影响。[45,46]其次，虽然传统的 芯片上微流体允许连续的球体生产，但液滴形成通常仅限于滴 水状态，导致低吞吐量(< 10μLmin-1)  ，这对于大多数临床应  用仍然不足。Z后，从它们的隔室中回收球体以进行进一步的 生物制造加工通常需要一个复杂的多步骤过程，这可能对细胞 存活产生不利影响。因此，仍然需要一种清洁、快速、细胞友 好和单步生物制造策略，使大型工程组织具有原位球化形成特 性。

在这里，我们介绍了一种新的空气微流体(IAMF)[48]为基  础的生物打印技术，克服了球体使用的翻译限制。具体来说， IAMF 实现了包含无生物材料细胞的隔室的生物物质工程，这  些隔室起到了球体形成微反应器的作用。有利的是，这种创新 方法代表了用于以临床相关速率(1-8.5 mL min-1相当于10000  个球体 s-1)产生高密度细胞球体的临床尺寸水凝胶的工程的单 步生物制造技术。生产能力的显著提高是由于 IAMF 能够单分 散地赋予喷墨生物印刷油墨在喷射状态下具有中空隔室，而传 统的芯片上方法仅限于更慢的滴水状态。这种新型的生物制造 过程也是非常清洁的，因为 IAMF 消除了传统上对油，表面活 性剂或牺牲模板的需要， 以在工程组织内创建空心隔室。除了 传统的基于机器的喷墨生物打印之外，我们证明我们的内联自 下而上的生物制造也可以以简单的手持设备的形式使用， 以手 动打印具有多种复杂性的球体形成的分隔水凝胶，这进一步促 进了该技术与临床应用的兼容性。虽然微型组织的大规模生产 的翻译挑战对于过多的不同组织类型是重要的[28] ，但我们  产生了临床大小的软骨组织作为模型组织，同时承认使用这种 方法也可以产生广泛的其他(器官)形状。

2. 结果和 讨 论

2.1. 空气微流体技术在分区水凝胶生物制备中的应用

IAMF 是一种微流体方法，通过在空气中将液体射流与由压电 驱动的液体射流产生的恒定周期的水滴流碰撞，使得能够以超 高吞吐量产生无芯片、无油和细胞相容的单分散微粒。 [48]

在这项研究中，我们将 IAMF 与喷墨生物打印相结合， 以允  许空气中形成的中空微胶囊的控制合并，从而能够生产大规模 的区室化水凝胶。为此，将两个微喷嘴设置与可移动的 XYZ收集工作台结合使用(图1a)。

为了形成中空微胶囊，含有氯化钙(CaCl 2)的核心微喷溶液  与通过使用压电驱动将振动叠加到微喷嘴上而产生的受控液滴 系统相撞(图1b)。具有降低表面张力(jcore  > jalgate)的海藻酸  盐前体微喷的 Dropjet 聚结允许 Marangoni 驱动的封装(图1c)  。这种封装过程发生在 je something (iμD4/阝j2)1/3的时间尺   度上，i，D ，μ 和 j 分别表示微喷密度，直径，粘度和表面张 力，通常在几毫秒内。这使得在收集液滴之前的10-100毫秒的  液滴飞行时间内可以完全封装。这使得能够生产含有 CaCl2 核 心和海藻酸盐前体外壳的双层液滴。由此产生的核壳(即海藻   酸钙)化合物液滴通过从核心层向海藻酸盐层扩散的 CaCl2  以内 向外的方式交联(图1d)。由于离子海藻酸盐交联发生在毫秒范  围内[50]  ，并且由于交联的内向外性质，当复合液滴仍然在空 气中时， 内部海藻酸盐层交联，而外部海藻酸盐层通过 Ca2  +  离子的内向扩散随时间发生交联。然后通过可移动的XYZ 收集器或微喷台以控制的方式收集部分交联的微胶囊。

值得注意的是，撞击的时刻是定时的，使得空气形成的微  囊的交联仍然在进行中，使得它们在着陆时立即与微囊进行物 理接触，从而有效地形成包含空心微隔室的瞬时固体3D 构建  体(图1e)。

我们假设通过使用标准的基于液滴的生物制造方法调整微  胶囊放置，可以以强大的，可预测的和可控的方式形成1D 纤  维，2D 平面和3D 体积的分区水凝胶(图1f)。使用手持生物打 印装置(图1g，h)证明了这种生物制造方法，其允许使用形状  稳定的区室化水凝胶手动直接填充缺陷(图1i-k)。该手持方法 预计将促进临床应用，如在外科手术过程中的原位生物打印。 此外，我们证明了这种新型的生物制造方法也可以与可编程3D生物打印机(图11，m)相结合，我们证明了允许生产由更复杂 的几何形状组成的大规模结构，如形状稳定的管状分区水凝胶 (图1n，o 和电影 S1，支持信息)。IAMF 的超高通量性质(高  达8.5 mL min-1)(图 S1，支持信息)允许以快速，直接和单步 方式生物制造临床尺寸的分区水凝胶(图1p，q)。

由于 IAMF 产生的液滴的超高吞吐量和短的空中飞行时间，通 常需要快速(毫秒)交联策略，如所提出的海藻酸盐离子交联或 光聚合。然而，依赖于较慢(几秒钟)交联机制的材料，如丝素 蛋白，仍然可以利用海藻酸钠作为牺牲结构互穿网络模板。