O2k能量代谢测量仪的实验材料制备方案

实验小技巧-小鼠心脏线粒体提取

1、准备工作

打开离心机，将离心机运转至低温4℃并保持温度。确保所有试剂缓冲液、实验解剖工具、组织匀浆工具以及离心机转子等均维持在4℃（或者在足够的冰上操作）

1.1小鼠处死办法

用颈脱位法处死实验用的小鼠

1.2线粒体提取流程

a) 实验解剖，取出小鼠心脏部位，去除多余的血管结构、结缔组织以及脂肪组织等，将处理好的心脏器官立刻放入BIOPS缓冲液中，整个过程在4℃环境（或冰上）进行

b) 在4℃条件下，将心脏器官放入有盖培养皿中，根据实验需要，单独提取左心室或者使用整个心脏；操作者需小心去除血液凝块等组织。将处理好的心脏放入10ml的玻璃烧杯中，加入1ml 4℃ BIOPS缓冲液（见2.1），取低温剪刀，将实验心脏组织剪碎至小块

c) 将组织碎块放入10ml手动玻璃研磨器中，加入2ml线粒体缓冲液B（见2.3），匀速手动研磨6-8次，形成心脏组织匀浆液

d) 将心脏组织匀浆液放入50ml离心管中，再加入3ml线粒体缓冲液B

e) 将上述液体在4℃、800g的条件下离心10min

f) 取出上清液，重新放置于新的50ml离心管中

g) 将该上清液再次在4℃、10000g条件下离心10min

h) 移除上清液，保留线粒体沉淀

i) 用500微升线粒体缓冲液A（见2.2）再次悬浮线粒体沉淀，然后，用线粒体缓冲液A将液体定容至2ml，形成线粒体悬浮液

j) 将线粒体悬浮液在4℃、10000g的条件下离心10min，保留沉淀

k) 用悬浮缓冲液（见2.4）再次悬浮线粒体沉淀，定容至200微升

l) 取5微升线粒体悬浮液直接加入O2k能量代谢测量仪的仓室中，用于线粒体呼吸能力的测量

m) 将剩余的线粒体悬浮液进行分装，每20微升放入一个离心管，零下20℃保存，用于后续的分析（蛋白浓度定量等）

2、试剂

2.1BIOPS器官组织缓冲液

常见于组织器官等实验材料的缓冲液，详细内容可咨询工作人员

2.2线粒体缓冲液A

2.3 线粒体缓冲液B

在10ml线粒体缓冲液A中加入5mg subtilisin

2.4 悬浮缓冲液

不带有BSA的线粒体缓冲液A

3、参考文献

1.Mela L , Seitz S (1979)Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.Methods Enzymol 55:39-46

2.Fontana-Ayoub M, Fasching M, Gnaiger E (2016) Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondr Physiol Network 03.02(18):1-10.

O2k细胞能量代谢分析系统的实验操作

01仪器校准

开机预热10min后，将2 ml（或0.5ml）呼吸介质放入仓室中，使用空气进行单点校准

02样本加入

用移液枪量取线粒体悬浊液体积，若体积为20微升，则先从仓室中移除20微升呼吸介质，再将20微升的线粒体悬浊液注入仓室中，确保仓室内的总体积不变，将上盖封闭，开始测量

03药物加入

根据实验需求按顺序加入相应药物，待一种药物加入后，软件曲线进入平台期，则可加入下一种药物，直至所有药物加入完全，并每种药物均出现平台期为最佳。注，其中FCCP等解偶联剂，需多次添加，直至找到zui大呼吸量为止，其他药物可根据常规浓度添加，若无法出现平台期，则可重复滴加，直至找到平台期

04数据计算

所有药物平台期可在软件上直接选择有效曲线波段（排除异常波动），软件可直接计算耗氧率等数据

05荧光参数

荧光参数需做介质校准和药物校准，软件提供完整的Protocol，按软件流程要求操作即可，其校准主要与介质的种类更换，药物的批次等有直接关系，若使用相同介质，同批次药物，则所有实验进行一次校准即可

06荧光参数实验流程

荧光测量流程与耗氧测量流程重复，两个实验为同时进行、同时测量，无需单独操作，结果与耗氧结果同时用软件分析