液滴微流控（六）：单细胞高通量液滴测序（Drop-seq）

细胞是生物结构与功能的基本单位，形态类型千差万别。通过细胞基因组学，可以描述细胞特性及功能，本文所介绍的单细胞（single-cell）高通量液滴测序（Drop-seq）技术，是一种快速分析成千上万个单细胞的方法，通过将每个细胞包裹在纳升级微滴中，进行RNA杂交并生成mRNA转录物，制作细胞基因表达谱，进一步可分析mRNA转录物的起源细胞。

原理简述

Drop-Seq基于液滴微流控技术，首先，将细胞悬浮液与带有分子条形码的微珠悬浮液泵至微流控芯片，汇聚并形成层流，之后再与油相汇聚，形成单分散的微滴，将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中，随后完成RNA杂交并裂解微滴，释放mRNA杂交物，完成逆转录，Z后，以PCR方式完成核酸扩增，并进行测序分析。

测序过程

1.准备材料：从组织中分离细胞，制备细胞悬浮液；制备带有分子条形码的微珠悬浮液。

2.制备微滴：将细胞悬浮液与微珠悬浮液泵至芯片，再与油相汇聚形成单分散的微滴，将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中。

3.RNA杂交：裂解微滴中的细胞，细胞释放mRNA，与微珠上的分子条形码杂交。

4.逆转录：裂解微滴，释放mRNA杂交物，开始逆转录，以形成mRNA逆转录物（STAMPS）。

5. PCR扩增：在核酸外切酶的作用下，将每条mRNA逆转录物“切下”，并以PCR方式进行核酸扩增，以放大基因信息。

6.测序分析：使用各种生物信息学工具进行测序分析。

为什么用液滴微流控？

液滴微流控将微体积样本快速分离，可实现成千上万个细胞的平行高通量分析，通常情况下，每秒可产生1000个微滴，每个微滴的体积为1nL，因此在试剂量上来讲，成本将成千倍的降低，此外，其实验过程无需用到流式荧光细胞仪等高端仪器，操作简单、快捷。

液滴测序芯片图解

此微流控芯片是开源的，开源链接：http://mccarrolllab.org/dropseq/。

液滴测序系统配置

液滴测序系统主要组件：

1.三个Flow EZ压力泵或一个MFCS EZ压力泵（四通道）。

2.三个流量监测传感器。

3.一个数字高速显微镜。

4.液滴测序微流控芯片。

Drop-Seq，其应用远不止对细胞形态类型的识别。目前，基因组遗传学研究正在研究识别许多导致疾病风险的基因，但生物学缺乏类似液滴测序的高通量基因识别方法，此外，将液滴测序与突变、病原体刺激等微扰动相结合，可以对多种细胞进行一个信息丰富的、多维度的解读，揭示微扰动对细胞的影响。

参考文献：

[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profi领 of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.