一种新型的灭活新冠病毒的抗原检测质控品开发

介绍 

新冠疫情促使检测新冠病毒的诊断方法快速开发。包括用于检测新冠病毒 RNA 的分子检测和用于检测新冠病毒抗原的侧向层析免疫检测。尤其是快速抗原检测，因具有显著的成本优势和易用性，成为新冠肺炎疫情期间一种很重要的检测新冠感染的办法。为了有效且高效的开发和验证这种检测，需要有高质量且经证实具有检验该检测方法性能的质控物质。为支持这些检测日益增长的使用量，重要的是开发可供实验室和检测生产商使用的非传染性灭活病毒衍生物。本研究旨在开发一种灭活的新冠病毒质控品，用于开发和验证基于抗原的检测方法。 

方法 

我们开发了一种辐照灭活方案，试图在完全灭活病毒的同时，改善热灭活方案中病毒蛋白的保留和完整性。通过感染性试验证实不存在感染性病毒，并使用 ELISA 对灭活样本中的核衣壳蛋白（N 蛋白）进行定量。本研究在纽约州布法罗的 ZeptoMetrix 公司进行。 

目的： 

• 评价新冠病毒辐照灭活方案的有效性

• 使用感染性试验证明辐照后不存在感染性病毒

• 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测灭活的新冠病毒样本中的 N 蛋白

• 证明 PROtrol 质控品可用于检验市售侧向层析免疫检测产品（LFIA）的性能

方法： 

取 2 个独立批次的新冠病毒感染性培养液（分离株：USA-WA1/2020 ）和每种变异株（ Delta, Omicron 和 Omicron BA.5）各 1 批，使用辐照灭活（PROtrol）和热灭活方案。通过组织培养半数感染剂量（TCID50）法测定病毒在灭活前的滴度，连续监测 VeroE6 细胞中细胞病变效应（CPE）7 天，评价所有样本的病毒感染力。使用 ZeptoMetrix 开发的 ELISA 法对新冠病毒 N 蛋白进行定量，分别测定了新冠病毒培养液（CF）、辐照灭活（PROtrol）培养液和热灭活（CFHI）培养液的 N 蛋白浓度。 

进一步评价 PROtrol 新冠病毒样本在来自生产商iHealth、On/Go、Abbot（BinaxNOW）和 Siemens （Clinitest）的四种市售侧向层析免疫检测产品中的反应活性。将 PROtrol 样本连续稀释（1：100 至 1：256000）到 PBS（磷酸盐缓冲液）中。将 50 uL PROtrol 稀释液分装至各管中，并使用各检测试剂的拭子收集。遵循生产商说明书对稀释液进行检测，直至观察到检测呈阴性。将Z后一次检测呈阳性的稀释液报告为终点稀释液。将 COA （实验室分析证明）中的报告值作为灭活前 TCID50/mL和 ng/mL 数值。（表 1） 

结果：

灭活样本在感染性试验中未出现细胞病变效应（CPE），因此表明不存在感染性病毒且完全灭活。 

ELISA 表明热灭活（CFHI）后 N 蛋白浓度显著降低。相反，与感染性培养液中观察到的水平相比，辐照灭活（PROtrol）样本中 N 蛋白水平基本上不受影响。与 CFHI 相比，PROtrol 样本保留的新冠病毒 N 蛋白免疫反应活性更佳（图 1）。 

结论 

热灭活培养物在抗原检测中往往会表现出高变异性，可能是由于蛋白质聚集或变性。为克服这一点，我们开发了一种全新的基于辐照的方法来灭活病毒，同时保留蛋白质的完整性和抗原表位，供抗原检测质控使用。 

本研究成功开发了新冠病毒抗原检测用灭活质控品 PROtrol。研究发现，与热灭活相比，辐照能在灭活病毒的同时更有效地保留蛋白质结构。感染性试验证实了不存在感染性病毒，ELISA 成功检测到灭活样本中的核衣壳蛋白。该研究成功达成其目的，即为实验室和检测生产商提供安全可靠的质控物质，确保检测准确。 

PROtrol?（Protein Control，蛋白质质控品）是一种非感染性、即用型质控品，经证实具有检验市售新冠病毒侧向层析免疫检测产品的性能。在抗原检测中，该物质可作为一种理想的分析和鉴定用质控品，可用于性能验证、方法确认和人员培训。PROtrol 可确保一致、可靠且准确的质控解决方案，评估不同批次的检测试剂盒和检测试剂的一致性。此外，还能公正且独立地评估检测能力。 

致谢

Lindsey Ruszczyk, BS, Amber Deering, BS, Nicole Williamson, BS, Karuna Sharma, PhD