文献速递丨naica®微滴芯片数字PCR检测核移植后的线

线粒体疾病是线粒体基因组（mtDNA）发生基因突变所导致的一类遗传疾病, 仅通过雌性种系传播。通常，细胞中超过60%的线粒体DNA发生突变就会导致疾病，并且一个人的线粒体DNA突变越多，其疾病就越严重，线粒体疾病目前是不可治愈的。

▲图源：网络（侵删）

目前核移植（NT），也称为线粒体捐赠，作为一种预防线粒体疾病从患病母亲传给其后代的战略而受到了越来越多的关注。但由于核移植中含有少量细胞质来源的mtDNA，介导受体中mtDNA异质性改变且伴有扩增，因此需要对mtDNA突变负荷进行准确定量，现用NGS测序方法局限性在于成本较高、耗时较长、数据处理复杂且信噪比较低。

Leber遗传性视神经病（LHON）Z常见的母系遗传性线粒体疾病，比利时根特大学生物系专家团利用数字PCR(dPCR)平台对LHON相关m.11778 G＞A突变位点进行检测，并和NGS方法进行对比，探讨数字PCR在mtDNA异质性定量中的适用性。研究成果发表在知名期刊《Clinical Chemistry》上。

检测样本信息:

为了评估dPCR在异质性评估中的适用性，共设置了3种类型的样品：（i）具有很高突变负荷的患者样品13个；（ii）由健康志愿者捐赠的同质野生型样品3个；（iii）经过NT处理的样品，由于mtDNA残留而携带低突变负荷，共6个样本。

检测方法：

通过处理，将样品突变负荷范围设置在50％至0.01％，进行分析验证。

实验结论:

☑  在dPCR和NGS结果上观察到的突变率具有良好的一致性。

☑与NGS相比，dPCR具有更低的背景噪声。使用naica®微滴芯片数字PCR系统，非患者样本中的突变等位基因没有阳性信号，符合预期。

☑  和dPCR结果相比，在NGS结果中几乎所有异质样品的次要等位基因频率都被高估，初步猜测NGS实验流程中可能引入了错误序列，经过PCR扩增改变次要等位基因频率。

☑  相较于NGS，数字PCR成本低、操作简便、结果直观、更适用于低频突变检测。

☑  数字PCR方法适合用于核移植后线粒体异质性定量检测。

▲naica®微滴芯片数字PCR系统检测不同mtDNA样本二维图（FAM-突变型，VIC-野生型）

左上：高突变负荷患者样本；右上：野生型样本；左下：NT后异质性样本；右下：NTC

▲Bland-Altman PLOT评估naica®微滴芯片数字PCR系统检测结果和NGS结果的一致性

文章conclusion给出-数字PCR具有更多优势，适用于核移植后线粒体的异质性评估：

▲ 图片来源：原文第8页

期刊介绍：

naica®微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的JD拷贝数浓度。