Martin Rausch团队提出用高速牵引显微镜测量骨骼肌纤维收缩力的方法
2024-03-18259
#骨骼肌# 收缩力#高速牵引力显微技术#
骨骼肌收缩力的测量对于评估人类和动物模型中骨骼肌组织的功能以及量化药物治疗遗传或与年龄相关的肌肉疾病的效果至关重要。然而，骨骼肌细胞在长时间的细胞培养中丧失大部分初始的收缩能力。传统的测量方法是将肌肉切片或新分离的单个肌纤维放在力传感器和长度驱动器之间，但这种这种方法不适合测试包含大量纤维的骨骼肌，如趾短屈肌（FDB），因为需要将每根纤维分离并连接到力传感器和长度驱动器之间，会非常费力费时，降低工作效率。本研究改进了牵引力显微镜技术以测量孤立的FDB纤维对电刺激的收缩反应。牵引力显微镜技术的原理是将细胞培养在弹性基质上，并测量基质在收缩力变化时的形变。如果已知弹性基质的性质，那么可以从测量的基质形变中计算出细胞对基质施加的牵引力。对于细胞培养在平面线性弹性基质表面的情况(二维牵引力显微镜),只需测量基质表面的基质变形即可。然而，新分离的肌肉纤维不能很好地附着在基质表面，因此必须嵌入三维(3D)基质中。然而，三维牵引力重建的计算方法相对较慢，使用共聚焦显微镜等手段测量三维基质形变也相对耗时，并且不适用于收缩力迅速变化的情况。2020年4月Martin Rausch团队在 BIOPHYSICAL JOURNAL上发表题为Measurement of Skeletal Muscle Fiber Contractility with High-Speed Traction Microscopy的研究文章，提出了一种用于同时测量嵌入三维基质中的肌肉纤维电脉冲刺激后的收缩力和钙动力学，与将肌肉纤维连接到力传感器的经典方法相比，该方法允许在不同治疗条件下对大量纤维进行高效、平行的分析。
首先，研究者发现，在单脉冲电场刺激期间，肌肉细胞收缩持续约100ms，Z大应变约为4-5%。在大多数情况下，肌纤维两端的荧光珠会沿着细胞长轴的方向向肌肉中心移动，移动距离与肌肉末端相近，这证实了之前关于细胞与基质之间无滑动约束条件的假设。基质变形的幅度随着与细胞表面距离的增加而减小。靠近细胞两极的珠子向细胞中心移动，而靠近细胞中心的珠子则远离细胞。这一观察结果在定性上与从有限元模拟中得出的预测一致。
此外，该研究还发现测量和预测的矩阵变形向量有很好的一致性，大多数细胞的皮尔逊相关系数达到或超过0.9。
研究者通过对于一系列具有不同细胞几何形状、应变和基质特性的模拟计算变形和牵引力场，发现肌纤维的总收缩力与基质弹性成线性比例,与纤维应变成线性比例,与纤维长度成二次方比例,与纤维直径成线性比例，加上在直径消失处(细长细胞)的力偏移，相当于收缩线段的力。
因此，根据纤维尺寸(松弛纤维的直径d和长度l)、收缩时的纤维应变ε以及基质的杨氏模量E，可以估算出肌肉纤维的总收缩力，公式如下：
这里，C?=0.455 μN表示典型参考纤维的收缩力，长度l?=300mm,直径d?=30mm,应变ε?=10%。l表示长度，d表示直径，ε表示要研究的肌肉纤维的应变，E表示基质的杨氏模量，与E?=200 Pa的参考环境进行比较。利用这一比例定律，嵌入线性弹性材料中的任何纤维的收缩力都可以通过公式1进行评估，而无需进行额外的有限元分析或测量基质变形。为了证明这个方法的实际应用性，该研究比较了有限元模拟计算的收缩率值和用公式 1 计算的收缩率值，这两种方法分别用于两个独立纤维分离的14个细胞（每个细胞有 7 根纤维）。两种方法之间的均方根差异为 4%，证实了缩放定律。研究发现，当用单脉冲电刺激纤维时，平均收缩力为 0.37± 0.15 μN。当分别计算时，两组肌肉的平均收缩力几乎相同，证实了该方法的可重复性。
为了证明该方法适用于药物测试，本研究首先用咖啡因处理FDB纤维。咖啡因能促进钙从SR中释放，从而在电刺激时提高肌肉张力。随着咖啡因剂量的增加，FDB纤维在单次脉冲和强直性刺激时的收缩力都会增加，但在10mM的剂量时除外，此时在强直性刺激期间的收缩力开始下降，而单次脉冲时的收缩力没有下降。仅从肌肉缩短数据来看，高剂量咖啡因时的这种效应并不明显，这说明在估算细胞收缩力时必须考虑整个细胞的几何形状(长度、直径、应变)。其次，用Tirasemtiv处理FDB纤维（Tirasemtiv是一种用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症，增加肌肉强度的药物，可以选择性地与快速骨骼肌钙蛋白复合物结合，并减缓肌钙蛋白C的钙释放速度。）与咖啡因处理的FDB纤维相似，随着Tirasemtiv剂量的增加，肌肉收缩力增加，尤其是单脉冲刺激，但在更高频率下，Tirasemtiv的作用减弱并Z终逆转。因此，Tirasemtiv只有在较低的刺激频率下才具有治疗效果，这与之前的报道一致。
接下来，本研究使用荧光染料Mag-Fluo-4将肌力测量与钙成像结合起来。研究者从共聚焦显微镜的单线扫描信号中提取了钙染料的平均荧光强度和肌纤维长度，并利用公式1将其转换为收缩力。
然后，测量同一细胞在不同电刺激频率下细胞膜钙离子浓度与收缩力之间的关系，发现在不同的刺激频率下，电诱导钙尖峰的Z大浓度几乎保持不变(图中的蓝线)。施加单个电脉冲后，细胞内钙浓度迅速达到峰值，然后在约100毫秒内下降至基线值。然而，当刺激频率超过10Hz时，每次脉冲后细胞内钙浓度都不会完全恢复到基线值，因此会随着时间的推移而累积。根据一阶激活动力学，收缩力（图中的橙线）近似于低通滤波后的钙信号（图中的虚线）。
综上所述，该研究模拟了不同几何形状（长度和直径）和收缩应变（细胞缩短）的圆柱形细胞周围的三维牵引力和应变场，得到了一个简单的缩放方程，从细胞形状、缩短率和基质僵硬度来计算整个肌肉收缩性。然后，通过真实肌肉细胞中心的单一二维平面验证了预测的矩阵变形场，该真实肌肉细胞的几何形状和对抗应变与模拟细胞相同。并且，该研究还使用有机钙指示剂Mag-Fluo-4在测量收缩力的同时测量肌质网(SR)的钙释放和再吸收。原文链接：https://www.cell.com/biophysj/fulltext/S0006-3495(19)34399-1
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