杭州谨澳生物科技有限公司
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谨澳透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

GZL优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

CFU-EC-1000D操作步骤)

 

简介

无细胞重组蛋白表达系统和传统的细胞内蛋白质表达系统相比,具有操作方便,可控性高的特点。该系统可以将DNA的转录和翻译在细胞外的环境中有效的结合起来。

GZL Bioscience开发的无细胞重组蛋白表达系统利用了细菌细胞提取物来完成上述过程。该细胞提取物含有DNA转录和翻译所需要的所有元件,包括核糖体、蛋白翻译因子、氨酰tRNA合成酶、总tRNA和蛋白质表达所需的其它组分。

在一个标准的GZL透析式无细胞重组蛋白表达反应中,用户需要将模板DNA(可以选用质粒大量提取产物或本试剂盒提供的Z-PCR反应产物)、细胞提取液和其他必须的组分混合在一起放入透析装置内,并放入特定的缓冲液中。缓冲液中的小分子,包括氨基酸、核苷酸、ATP和其他因子会与透析装置内的小分子进行交换,促进和提高蛋白质产量。


下图解释了一个透析式无细胞蛋白表达反应的基本设置(Figure 1)。

 

Figure 1: 透析式无细胞重组蛋白表达反应示意图

 

 

 

 

无细胞重组蛋白表达系统有着诸多的应用

(1) 膜蛋白表达;

(2) 同位素标记;

(3) 毒性蛋白表达;

(4) 高通量蛋白表达*

本剂盒优化了无细胞蛋白表达过程中的各组分构成,可辅助完成非天然氨基酸定点标记ǂ

*本试剂盒基于原核生物开发,适合细菌和病毒等蛋白的表达,不建议表达具有丰富二硫键和复杂翻译后修饰的蛋白;

ǂ本试剂盒部分组分需从其他机构购买,请联系我方客服了解具体情况;

 

 

下图中展示了以DNA质粒为模板,通过无细胞重组蛋白体系所表达蛋白的凝胶分析核磁分析Figure 2


Figure 2

 

A: SDS-PAGE10%)对表达后的目标蛋白的分析:

1:为未离心过的无细胞反应样品;

2:为离心后的上清液样品;

M:为 LMW 蛋白标准样

:为过量表达的人碳酸酐酶;

该图说明表达的目标蛋白绝大多数为可溶蛋白

 

B: 15N标记的人碳酸酐酶的15N-HSQC核磁共振谱图。

 

 

GZL 优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒试剂盒组分、用户需准备材料及DNA模板制备

 

本试剂盒组分:

 

除透析装置外,所有试剂盒中的组分都应储存在-80 °C。在反应前将所有低温保存的组分放在冰上解冻。反复冻融会明显降低组分活性和蛋白表达效果,应尽量避免。如需多次使用同一组分,建议在第一次解冻后将各组分分装入灭菌离心管中,再用液氮速冻并放入-80 °C中保存。

 

透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

Cat.   # CFU-EC-1000D

每个试剂盒可提供5 × 200 uL 反应.

·           100 uL       优化型大肠杆菌提取液(Modified E.   coli cell extract

150 uL       大肠杆菌提取液(E. coli cell extract

·           345 uL       优化型反应预混液(Modified   reaction mix

348   uL       反应预混液(Reaction mix

·            10 mL        透析外液(Outer mix

·            40 uL       对照DNA模板(Control template DNA; 编码绿色荧光蛋白

·           400 uL       稀释用缓冲液(Dilution buffer

500 uL       稀释用缓冲液(Dilution   buffer

·             5 ×        透析装置(Dialysis   system;含透析装置及外液管

·           190 uL       PCR1   反应预混液*

·           190 uL       PCR2   反应预混液*

·            16 uL       Z1高保真DNA聚合酶

·             4 uL         Z2超保真DNA聚合酶

 

*内含dNTP、引物、Mg2+和缓冲液等。

 

 

用户需准备材料

 

·         DNA酶与RNA酶的0.5 mL离心管或1.5 mL 离心管;

·         高压灭菌纯水;

·         30 °C 培养箱或温控摇床;

·         低温台式小型离心机;

·         SDS-PAGE凝胶电泳;

·         选:蛋白纯化装置和耗材,包括Ni-NTAGSTrap柱等;

·         包含目标蛋白DNA序列的模板DNA(如选择直接采用质粒作为模板,请采用Maxiprep DNA质粒,不可采用Miniprep质粒;如选择采用本试剂盒包含的Z-PCR反应作为模板,请阅读以下Z-PCR操作步骤)

 

DNA模板制备:

 

用于此无细胞重组蛋白表达反应中的DNA模板可以是Z-PCR产物或DNA质粒(必须为质粒大量提取产物,且该DNA模板不能含有DNA酶和RNA酶)。

DNA模板(Figure 3)需要包含一个T7启动子(T7 promoter),核糖体结合位点(RBS;位于ATG起始密码子上游7–11核酸的位置),ATG起始密码子(ATG start codon),终止密码子(stop codon)和一个T7终止子(T7 terminator)

建议在目标蛋白序列上加上亲和标签(如 6×His标签或GST标签),便于蛋白表达后的纯化。由于该无细胞蛋白表达系统基于大肠杆菌开发,建议用户在制备DNA模板前做好密码子优化和内显子去除等工作。

Figure 3: 用于无细胞重组蛋白表达的DNA模板的示意图

 

本试剂盒包含了两套Z-PCR反应预混液(PCR1PCR2反应预混液),适用于扩增具有T7启动子和终止子的DNA片段。

该预混液内包含了dNTP、引物(可与T7启动子和终止子序列重合),Mg2+和缓冲液,用户只需添加小量提取质粒和附送的高(超)保真DNA聚合酶便可完成对目的基因的扩增。PCR扩增结束后需要将两个PCR反应产物混合并进行95°C处理,待PCR混合液降至室温后即可用于无细胞蛋白表达反应。

GZL 优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒(#CFU-EC-1000D)操作步骤

 

Z-PCR操作步骤(如采用大量提取质粒作为模板,可跳过此步骤):

 

1.  PCR反应建立:

 

*注意:以下PCR反应只可扩增插入T7启动子和终止子(如pET载体)中的目的基因。

 

PCR反应1*

PCR反应2*

190 uL      PCR1 反应预混液

(不含聚合酶)

190 uL      PCR2 反应预混液

(不含聚酶)

8 uL        Z1高保真DNA聚合酶

2 uL      Z2 超保真DNA聚合酶

8 uL      Z1 高保真DNA聚合酶

2 uL      Z2 超保真DNA聚合酶

2 uL        DNA质粒模板

>30 ng/uL

2 uL      DNA质粒模板

>30 ng/uL

x uL        纯水

x   uL     

200 uL

200 uL

 

*可根据需要增加或减少PCR反应量,建议客户第一次使用该试剂盒时先进行小规模PCR实验对PCR条件及聚合酶的选用进行优化,务必选用产量高且均一的PCR产物进行下游蛋白表达;

*建议将PCR分装成50 uL/管进行PCR反应;

*注意:用户放入PCR反应1PCR反应2中的DNA质粒模板必须为相同模板。

 

2.  建议PCR反应条件:

 

温度

时间

1 Cycle

98 °C

3 min

30-33 Cycles

98 °C
 
52 °C

72 °C

20 s
 
15 s
  25
s/kb Z2超保真DNA聚合酶)

60 s/kb Z1高保真DNA聚合酶)

1 Cycle

72 °C

3 min


4–10 °C

 

3.      PCR反应1PCR反应21:1比例混合;

4.      放入95 °C水浴或其他热源中静置8分钟;

5.      缓慢(可将热源断电使其自然降温)降温至室温建议通过琼脂糖凝胶电泳检验该PCR产物);

6.      可直接用于无细胞蛋白表达,或放入-20 °C待以后使用。

建立5 × 200 uL无细胞蛋白表达反应:

 

1.      -80 °C下储存的试剂盒组件放在冰上解冻;

2.      按以下描述在冰上建立反应:

 

v  反应内液:按以下描述将各反应组件混合

组件

用户反应(×3)

阴性对照反应

阳性对照反应

优化型预混

Modified Reaction mix

使用前请混匀!

69 uL

69 uL

69 uL

模板DNA

16 ng/uL大提质粒DNA

40 uL Z-PCR产物

0

40 uL

大肠杆菌提取液

E. coli cell extract

优化型大肠杆菌提取液Modified E. coli cell extract

使用前请混匀!

30 uL

20 uL

30 uL

20 uL

30 uL

20 uL

aaRS

需客户从其他机构自行购买;

普通蛋白表达无需添加该组分

4 uL

4 uL

4 uL

稀释用缓冲液

Dilution buffer直至

200 uL

200 uL

200 uL

 

v  反应外液:按以下描述将透析外液(Outer mix分装至自带外液管

组件

用户反应(×3

阴性对照反应

阳性对照反应

氨基酸 (Amino acid)

需客户从其他机构自行购买

普通蛋白表达无需添加该组分

加至终浓度

1 mM

 加至终浓度

1   mM

加至终浓度

1 mM

透析外液Outer mix

2 mL

2 mL

2 mL

 

3.      将反应内液充分混合后,离心5秒钟,使管壁上残留的液体流入离心管部;

4.      转移反应内液至提供的透析装置内,并盖上盖子;

5.      将该透析装置置于盛有反应外液的外液管并旋上盖子;

6.      置于30 °C(静置或低速震荡)中过夜;

7.      将透析装置内的反应液转移至灭菌离心管内,并离心(≥ 14 000 g4 °C

10分钟);

8.      将上清液转移至灭菌离心管内。用户可选择直接用其进行下游分析,或低温保存;

9.      3–5 uL反应样品,并用SDS-PAGE凝胶电泳检查目标蛋白是否表达。

 

 

反应建立步骤简图:

 

:反应内液准备

 

1-1:加入反应预混液和

大肠杆菌提取液

 

 

1-2: 加入模板DNA

 

 

1-3:加入稀释缓冲液

 

 

1-4:混匀

 

 

1-5:离心5

 

 

2:反应外液准备

 

2:加入透析外液于外液管(为平底;

   请以实物为准)中

 

 

3:反应建立

 

3-1:反应内液转移至透析装置内

 

 

3-2:将透析装置置于外液管中

 

 

3-330(静置或低速震荡)过夜

 

 

3-4:反应液转移至灭菌离心管

 

 

3-5:离心(取上清和沉淀样品

进行下游鉴定)

 

 

注意:

1.      该反应对核酸酶非常敏感,因此请务必全程佩戴手套,并采用去核酸酶的溶剂枪头和离心管。

 

2.      模板DNA的纯度和浓度对该反应至关重要,因此请务必在反应前检查并确认DNA模板样品的质量。模板DNA不能为Miniprep样品

 

3.      建议做200 uL阴性对照反应,用其跟用户反应或阳性对照反应对比,进而确认目的蛋白或对照蛋白是否表达。

GZL无细胞蛋白表达试剂盒产品目录

品名

Cat. No.

介绍

GZL优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

CFU-EC-1000D

该试剂盒可提供5 × 200 uL 反应

GZL优化型高通量透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

CFU-EC-8000D

该试剂盒(含高通量透析装置)可提供共8 × 1 mL 反应

 

无细胞重组蛋白表达系统有着诸多的应用。(1) 客户可以利用在反应中添加表面活性剂或其他添加剂的方法来提高膜蛋白的表达量和活性。(2) 可以将昂贵的同位素标记蛋白和非天然氨基酸标记蛋白的表达成本降低到可以让普通实验室接受的程度。(3) 客户可以有效的表达细胞内系统无法表达的毒性蛋白。(4) 可以实现高通量蛋白质表达。该高通量系统可以与质谱,核磁共振,蛋白结晶,生化反应等下游分析手段结合,不仅可以缩短实验时间,还将让您在较短的时间内得到更多的实验数据。由于其无可比拟的优势,不同领域的研究人员已经在用它表达抗体药物,同位素标记蛋白质和非天然氨基酸标记蛋白质,并不断发表高质量的科学论著。
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