谨澳透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

GZL优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒

（CFU-EC-1000D操作步骤）

简介

无细胞重组蛋白表达系统和传统的细胞内蛋白质表达系统相比，具有操作方便，可控性高的特点。该系统可以将DNA的转录和翻译在细胞外的环境中有效的结合起来。

GZL Bioscience开发的无细胞重组蛋白表达系统利用了细菌细胞提取物来完成上述过程。该细胞提取物含有DNA转录和翻译所需要的所有“元件”，包括核糖体、蛋白翻译因子、氨酰tRNA合成酶、总tRNA和蛋白质表达所需的其它组分。

在一个标准的GZL透析式无细胞重组蛋白表达反应中，用户需要将模板DNA（可以选用质粒大量提取产物或本试剂盒提供的Z-PCR反应产物）、细胞提取液和其他必须的组分混合在一起放入透析装置内，并放入特定的缓冲液中。缓冲液中的小分子，包括氨基酸、核苷酸、ATP和其他因子会与透析装置内的小分子进行交换，促进和提高蛋白质产量。

下图解释了一个透析式无细胞蛋白表达反应的基本设置（Figure 1）。

Figure 1: 透析式无细胞重组蛋白表达反应示意图

无细胞重组蛋白表达系统有着诸多的应用：

(1) 膜蛋白表达；

(2) 同位素标记；

(3) 毒性蛋白表达；

(4) 高通量蛋白表达*。

本剂盒优化了无细胞蛋白表达过程中的各组分构成，可辅助完成非天然氨基酸定点标记ǂ。

*本试剂盒基于原核生物开发，适合细菌和病毒等蛋白的表达，不建议表达具有丰富二硫键和复杂翻译后修饰的蛋白；

ǂ本试剂盒部分组分需从其他机构购买，请联系我方客服了解具体情况；

下图中展示了以DNA质粒为模板，通过无细胞重组蛋白体系所表达蛋白的凝胶分析和核磁分析（Figure 2）

Figure 2

A: SDS-PAGE（10%）对表达后的目标蛋白的分析：

1：为未离心过的无细胞反应样品；

2：为离心后的上清液样品；

M：为 LMW 蛋白标准样；

→：为过量表达的人碳酸酐酶；

该图说明表达的目标蛋白绝大多数为可溶蛋白。

B: 15N标记的人碳酸酐酶的15N-HSQC核磁共振谱图。

GZL 优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒试剂盒组分、用户需准备材料及DNA模板制备

本试剂盒组分:

除透析装置外，所有试剂盒中的组分都应储存在-80 °C。在反应前将所有低温保存的组分放在冰上解冻。反复冻融会明显降低组分活性和蛋白表达效果，应尽量避免。如需多次使用同一组分，建议在第一次解冻后将各组分分装入灭菌离心管中，再用液氮速冻并放入-80 °C中保存。

用户需准备材料：

·         去DNA酶与RNA酶的0.5 mL离心管或1.5 mL 离心管；

·         高压灭菌纯水；

·         30 °C 培养箱或温控摇床；

·         低温台式小型离心机；

·         SDS-PAGE凝胶电泳；

·         选：蛋白纯化装置和耗材，包括Ni-NTA柱、GSTrap柱等；

·         包含目标蛋白DNA序列的模板DNA(如选择直接采用质粒作为模板，请采用Maxiprep DNA质粒，不可采用Miniprep质粒；如选择采用本试剂盒包含的Z-PCR反应作为模板，请阅读以下Z-PCR操作步骤)。

DNA模板制备：

用于此无细胞重组蛋白表达反应中的DNA模板可以是Z-PCR产物或DNA质粒（必须为质粒大量提取产物，且该DNA模板不能含有DNA酶和RNA酶）。

该DNA模板（Figure 3）需要包含一个T7启动子(T7 promoter)，核糖体结合位点（RBS;位于ATG起始密码子上游7–11核酸的位置），ATG起始密码子(ATG start codon)，终止密码子(stop codon)和一个T7终止子(T7 terminator)。

建议在目标蛋白序列上加上亲和标签（如 6×His标签或GST标签），便于蛋白表达后的纯化。由于该无细胞蛋白表达系统基于大肠杆菌开发，建议用户在制备DNA模板前做好密码子优化和内显子去除等工作。

Figure 3: 用于无细胞重组蛋白表达的DNA模板的示意图

本试剂盒包含了两套Z-PCR反应预混液（PCR1和PCR2反应预混液），适用于扩增具有T7启动子和终止子的DNA片段。

该预混液内包含了dNTP、引物（可与T7启动子和终止子序列重合），Mg2+和缓冲液，用户只需添加小量提取质粒和附送的高（超）保真DNA聚合酶便可完成对目的基因的扩增。PCR扩增结束后需要将两个PCR反应产物混合并进行95°C处理，待PCR混合液降至室温后即可用于无细胞蛋白表达反应。

GZL 优化型透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒(#CFU-EC-1000D)操作步骤

Z-PCR操作步骤（如采用大量提取质粒作为模板，可跳过此步骤）：

1.  PCR反应建立：

*注意：以下PCR反应只可扩增插入T7启动子和终止子（如pET载体）中的目的基因。

*可根据需要增加或减少PCR反应量，建议客户第一次使用该试剂盒时先进行小规模PCR实验对PCR条件及聚合酶的选用进行优化，务必选用产量高且均一的PCR产物进行下游蛋白表达；

*建议将PCR分装成50 uL/管进行PCR反应；

*注意：用户放入PCR反应1和PCR反应2中的DNA质粒模板必须为相同模板。

2.  建议PCR反应条件：

3.      将PCR反应1和PCR反应2以1:1比例混合；

4.      放入95 °C水浴或其他热源中静置8分钟；

5.      缓慢（可将热源断电使其自然降温）降温至室温（建议通过琼脂糖凝胶电泳检验该PCR产物）；

6.      可直接用于无细胞蛋白表达，或放入-20 °C待以后使用。

建立5 × 200 uL无细胞蛋白表达反应:

1.      将-80 °C下储存的试剂盒组件放在冰上解冻；

2.      按以下描述在冰上建立反应:

v  反应内液：按以下描述将各反应组件混合：

v  反应外液：按以下描述将透析外液（Outer mix）分装至自带外液管：

3.      将反应内液充分混合后，离心5秒钟，使管壁上残留的液体流入离心管部；

4.      转移反应内液至提供的透析装置内，并盖上盖子；

5.      将该透析装置置于盛有反应外液的外液管并旋上盖子；

6.      置于30 °C（静置或低速震荡）中过夜；

7.      将透析装置内的反应液转移至灭菌离心管内，并离心（≥ 14 000 g，4 °C，

10分钟）；

8.      将上清液转移至灭菌离心管内。用户可选择直接用其进行下游分析，或低温保存；

9.      取3–5 uL反应样品，并用SDS-PAGE凝胶电泳检查目标蛋白是否表达。

反应建立步骤简图：

：反应内液准备

1-1：加入反应预混液和

大肠杆菌提取液

1-2： 加入模板DNA

1-3：加入稀释缓冲液

1-4：混匀

1-5：离心5秒

2:反应外液准备

2：加入透析外液于外液管（为平底；

   请以实物为准）中

3：反应建立

3-1：反应内液转移至透析装置内

3-2：将透析装置置于外液管中

3-3：30℃（静置或低速震荡）过夜

3-4：反应液转移至灭菌离心管

3-5：离心（取上清和沉淀样品

进行下游鉴定）

注意:

1.      该反应对核酸酶非常敏感，因此请务必全程佩戴手套，并采用去核酸酶的溶剂、枪头和离心管。

2.      模板DNA的纯度和浓度对该反应至关重要，因此请务必在反应前检查并确认DNA模板样品的质量。模板DNA不能为Miniprep样品。

3.      建议做200 uL阴性对照反应，用其跟用户反应或阳性对照反应对比，进而确认目的蛋白或对照蛋白是否表达。

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