涡旋混合器在染色体标本FISH技术中的应用

       涡旋混合器在染色体标本FISH技术中的应用

       (一)实验目的

       1.掌握FISH技术的一般原理及其基本实验方法；

       2.了解FISH技术的发展概况和应用范围。

       (2)实验原理

       FISH是一种基于分子杂交的方法，利用非放射性荧光物质标记核酸探针，通过碱基互补的原理与目标DNA杂交，显示目标DNA序列在细胞核或染色体中的位置。 FISH技术可分为四个步骤：样品制备、探针标记、杂交和检测。

       (3)实验准备

       1.材料染色体标本或血涂片

       2、试剂甲醇、乙醇、乙酸、标记探针（生物素标记探针或地高辛标记探针）、3mol/L乙酸钠、甲酰胺（分子生物学级及粗品）、杂交缓冲液（4×SSC、20%葡萄糖）硫酸盐）、鲑鱼精子 DNA、磷酸钠、Tween20、BSA、检测溶液（5 μg/ml 荧光素偶联亲和素或 6 μg/ml 罗丹明偶联抗地高辛抗体）DAPI

       3． 仪器设备 低温高速离心机、荧光显微镜、MixPlus涡旋混合器、移液器、恒温水浴锅、培养箱、烘箱

       (4) 实验方法和步骤

       1.探针混合和变性

       (1) 将 20 至 60 ng 标记探针 DNA 和 3 至 5 μg 鲑鱼精子 DNA 混合。 若反应后体积小于10μl，可直接冻干； 若体积较大，可加入1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的100%乙醇沉淀DNA。 充分混合并在-70°C 下孵育 30 分钟。 4℃、12000r/min离心10分钟，弃上清，用300μl 70%乙醇洗涤沉淀，离心（同上），弃上清，冻干。

       (2) 将 DNA 重悬于 5 μl 去离子甲酰胺中，室温涡旋 3 分钟。

       (3) 加入5μl杂交缓冲液，在MixPlus涡旋混合器中混合5分钟。

       (4) 将 DNA 探针在 75°C 水浴中变性 5 分钟。 迅速放入冰浴中5分钟，备用。

       2.样品处理

       (1)染色体制备标本或血涂片分别在70%、90%、100%乙醇中室温脱水，每次5分钟。 让它冷却并放在一边。

       (2) 变性前将载玻片放入60°C烘箱中孵育，以防止向载玻片添加变性溶液时温度下降。

       (3) 将变性溶液在水浴中加热至70°C。

       (4)将预热的载玻片移至装有变性溶液(70%去离子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸钠)的Coplin罐中2分钟。

       (5)立即将载玻片移入70%、90%和100%预冷的乙醇中各5分钟。 防止DNA复性。

       (6)风干。

　     3． 杂交

       (1) 将 10 μl 含有变性探针的杂交混合物添加到载玻片上变性的目标 DNA 上。

       (2) 用盖玻片盖住杂交液，防止产生气泡。

       (3) 用橡皮泥密封盖玻片，并将其置于 37°C 的潮湿盒中过夜。

       4． 检测

       (1) 从湿盒中取出载玻片，除去橡皮泥。

       (2)将载玻片放入预热至42℃的冲洗液A(50%甲酰胺，2×SSC)中，在恒温水浴摇床中摇动10分钟，让盖玻片脱落。 更换冲洗液A两次，每次摇动5分钟。　　

       (3)将载玻片移入预热60℃的冲洗液B(1×SSC～0.1×SSC，pH 7.0，根据实验需要调节)中，冲洗5分钟，更换冲洗液B两次，每次5分钟每一次。　　

       (4)取出载玻片，甩干液体，加入200μl封闭液(3%BSA、4×SSC、0.1%Tween20)，盖上盖玻片，防止产生气泡，置于湿润的培养皿中。盒中，并在 37°C 下加热。 30多分钟。　

       (5) 取下盖玻片，除去多余液体，加入200 μl检测液（5 μg/ml 荧光素标记亲和素或 6 μg/ml 罗丹明标记抗地高辛抗体，缓冲液为 1% BSA，4×SSC和 0.1Tween20)，在潮湿的盒子中于 37°C 孵育 30 分钟。

       (6) 取下盖玻片，将载玻片放入冲洗液C（4×SSC，0.1% Tween20，pH7.0）中，42℃振荡冲洗3次，每次5分钟。

       (7) 将载玻片置于复染液(2×SSC，200ng/mlDAPI)中，室温振荡20分钟。

       (8) 将载玻片在冲洗液D（2×SSC，0.05% Tween20）中室温孵育1至2分钟。

       (9)荧光显微镜下观察。