植物油中氯丙醇酯和缩水甘油酯含量测定解决方案（快速碱水解方法）——ISO 18363-4

氯丙醇酯污染是近年来国际上出现的食品安全热点问题之一，氯丙醇酯是氯丙醇类化合物与脂肪酸的酯化产物，食品中检出量较高的是3-氯丙醇酯。近年来的研究发现，在谷物、咖啡、鱼、肉制品、马铃薯、坚果和以植物油为原料的热加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯检出。尤其精炼植物油等食品中检出3-氯丙醇酯的报道逐渐增加。缩水甘油酯是脂肪酸与缩水甘油的酯化产物，它与氯丙醇酯是一对孪生兄弟，形成机理相似。在油脂精炼过程中，缩水甘油酯通常会伴随3-氯丙醇酯一起形成，3-氯丙醇酯含量高，缩水甘油酯含量也高。3-MCPD可损害肾脏和生殖系统等，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将游离态3-MCPD列入2B类致癌物清单，将游离态缩水甘油列入2A类致癌物清单。

安谱实验和南京海关动植物与食品检测中心共同合作，参照国际标准“ISO 18363-4:2021”和国标征求意见稿“GB 5009.191-×××× 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定”第二篇第 一法，并对方法进行优化，使用快速碱水解方法进行酯键断裂，苯基硼酸进行衍生，气相色谱-串联质谱进行检测，内标法进行定量，对不同植物油中的氯丙醇酯和缩水甘油酯的含量进行了检测，方法操作简便，回收率高，精密度好。

目前安谱实验与南京海关动植物与食品检测中心已建立战略合作伙伴关系。近年来，双方已在科研项目、技术服务、培训合作、能力验证等多个层面展开合作。南京海关动植物与食品检测中心是隶属于南京海关的独立法人第三方事业单位，主要承担进出境食品、化妆品、动植物及其产品的法定检验、检测、检疫工作。在食品领域检测能力卓 越，获得国家CNAS认可、CMA资质认定和CNAS能力验证计划提供者等国内外权威资质。目前南京海关动植物与食品检测中心已完全具备食品中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测能力，并积累了多种基质的检测经验。

一、原理

试样中加入同位素内标，用甲醇钠溶液进行酯键断裂反应，3-氯-1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和缩水甘油酯分别转化为游离态3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、缩水甘油（Gly）和相应的脂肪酸甲酯；以酸性溴化钠溶液进行中和，生成的缩水甘油转化为稳定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）；试液经净化去除脂肪酸甲酯等杂质后，进行苯基硼酸衍生，以气相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。

酯键断裂反应中，生成的游离态3-MCPD在碱性条件下会部分转化成缩水甘油，经酸性溴化钠溶液作用生成3-MBPD；同位素13C3-3-MCPD在相同条件下转化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD转化成3-MBPD的比例一致，通过转换关系对试液中总缩水甘油含量进行修正，得到试样中缩水甘油酯含量。

二、标准品

实验用到的标准品信息见下表：

表1 标准品信息

1、标准品溶液配置

混合标准储备液（3-MCPD:54.7 µg/mL，2-MCPD:49.7 µg/mL，Gly:57.8 µg/mL）：准确称取5.81 mg 3-MCPD-PP、5.79 mg 2-MCPD-SS和4.88 mg GLy-P于20 mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

混合标准工作溶液I（3-MCPD:8.2 µg/mL，2-MCPD:7.5 µg/mL，Gly:8.7 µg/mL）：准确移取750 μL混合标准储备溶液至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

混合标准工作溶液II（3-MCPD:3.3 µg/mL，2-MCPD:3.0 µg/mL，Gly:3.5 µg/mL）：准确移取300 μL混合标准储备溶液至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

混合标准工作溶液III（3-MCPD:0.16 µg/mL，2-MCPD:0.15 µg/mL，Gly:0.17 µg/mL）：准确移取100 μL混合标准工作溶液I至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

内标储备液（13C3-3-MCPD:46.9 µg/mL，D5-2-MCPD:50.2 µg/mL，D5-GLy:63.8 µg/mL）：分别准确称取1.22 mg 13C3-3-MCPD-PP标准品、1.41 mg D5-2-MCPD-SS标准品、1.28 mg D5-Gly-P标准品于3个5 mL容量瓶中，用甲苯溶解并定容至刻度，混匀。

内标混合标准工作溶液（13C3-3-MCPD:1.876 µg/mL，D5-2-MCPD:1.004 µg/mL，D5-Gly:1.276 µg/mL）：分别准确移取1.0 mL 13C3-3-MCPD-PP内标储备溶液、0.5 mL D5-2-MCPD-SS内标储备溶液和0.5 mL D5-GLy-P内标储备溶液至25 mL容量瓶中，用甲苯稀释并定容至刻度。

标品配制注意事项

1.标准溶液浓度需根据标品实际称样质量、标品纯度以及目标物折算系数进行具体计算。

2.可选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

2、基质标准曲线配制

称取100 mg橄榄油基质空白油，装入10个独立的样品瓶。如下表所示，加入甲苯、tBME、内标工作溶液和相应的混合标准工作溶液，按照“样品前处理”进行操作，上机检测得到标准曲线。

表2 标准曲线的配制

三、前处理步骤

试剂配置：

硫酸水溶液（25%）：将25 mL硫酸转移至含有50mL纯水的100mL容量瓶中。用纯水稀释至刻度线并混匀。

酸性溴化钠溶液（溴化钠600 mg/mL，硫酸体积分数为0.9%）：将60 g溴化钠溶解于70 mL纯水中。将溴化钠溶液转移至含有3.6 mL 25%硫酸溶液的100mL容量瓶中。用纯水稀释至刻度线并混匀。

甲醇钠溶液（0.35 mol/L）：将8 mL甲醇钠溶液（质量分数为25%）转移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线并混匀。

苯基硼酸溶液：称取12.0 g苯基硼酸，加入100 mL 的丙酮:水=(95:5)溶液，混匀。

试样提取：

准确称取0.10~0.12 g（精确至0.0001 g）食用油/油脂样品于螺口玻璃试管 (货号：VJEQ-38013CT-13100-100)中，加入100 μL甲苯、200 μL叔丁基甲醚，再加入100 μL内标混合标准工作溶液。涡旋混匀10 s，10°C水浴冷却至少4 min。

酯交换反应：

加入100 μL 0.35 mol/L甲醇钠溶液，盖紧盖子，涡旋混匀10 s，开始酯交换反应。继续10°C±1℃水浴10 min。然后加入300 μL酸性溴化钠溶液，停止反应。涡旋混匀10 s，让温度稳定在室温静置至少5 min，以使所有缩水甘油完全转化为 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）。

试样净化：

在样品中加入300 μL异辛烷，涡旋混匀10 s，取出上层有机相，弃去。再加入600 μL异辛烷，涡旋10 s，然后取出上层有机相，弃去，注意不要取到任何水层。

衍生化反应：

向净化液中加入100 μL苯基硼酸溶液，涡旋20 s后，加入600 μL异辛烷，涡旋混匀10 s，移取上层含有衍生物的有机相，加入0.5g无水硫酸钠，涡旋混匀10 s，提取液过0.22 μm的疏水性PTFE针式滤器后供气相色谱-串联质谱仪进行测定。

前处理注意事项

1.若样品常温下为固体，称样后可在 80℃水浴，250 r/min震荡搅拌2 min，直至所有脂肪融化溶解；

2.0.35 mol/L甲醇钠溶液建议存放在4℃条件下，临用前拿出；

3.10°C低温酯交换反应时需尽量将整个螺纹瓶浸泡在水中，以保证螺纹瓶内温度稳定；

4.试样净化过程时，若出现凝固现象，可在 80℃下水浴振荡，至样品溶液完全溶解，待样品冷却后取出上层有机相弃去；

5.前处理过程中尽量避免试样塑料耗材，可使用玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手动进样针等耗材，建议进行方法空白实验监控过程本底情况；

6.建议使用疏水性PTFE针式滤器进行过滤；

7.前处理过程中会存在3-氯-1, 2-丙二醇酯转换生成的缩水甘油（Gly）的副反应，在上述条件下，13C3-3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸双酯（13C3-3-MCPD-PP）转换为13C3-Gly的转换率需控制在10%左右，如转换率过高需排查前处理过程；

8.在上述条件下，2-MCPD可转化为缩水甘油的比率<1%，可以忽略不计。

四、仪器条件

气相色谱-串联质谱联用仪

色谱柱：毛细管气相色谱柱CD-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

进样量：2μL

进样口温度：300℃

进样模式：不分流进样

载气：氦气，纯度≥99.999 %

色谱柱流速：1.0mL/min

程序升温：70 ℃保持1 min，10 ℃/min升至100 ℃，5 ℃/min升至180 ℃，以25 ℃/min升至320 ℃保持5 min。

传输线温度：320℃    离子源温度：280℃

离子化能量：70eV     溶剂延迟时间：8min

扫描模式：多反应监测模式（MRM模式），离子对信息见下表：

表3 目标物离子对信息

仪器维护注意事项

1.随着进样次数的增加，仪器轻微污染，目标物保留时间可能发生偏移；

2.该实验对仪器污染比较严重，仪器受到严重污染后，可能导致目标物响应降低、分离度变差等情况，需注意仪器的清洗维护，包括进样针的清洗，离子源的清洗，色谱柱的老化等；

3.如仪器配制程序升温进样口和反冲功能，可明显降低对仪器的污染程度。

4.建议色谱柱加装2m 相同固定相的预柱，定期对预柱进行更换，可延长色谱柱的使用寿命。

五、实验谱图

图1 氯丙醇酯和缩水甘油酯标准溶液谱图

（标线第5点  STD-5）

图2 橄榄油样品空白和样品加标的TIC谱图

（上图为样品空白，下图为样品加标1mg/kg）

图3 大豆油样品空白和样品加标的TIC谱图

（上图为样品空白，下图为样品加标1mg/kg）

图4 菜籽油样品空白和样品加标的TIC谱图

（上图为样品空白，下图为样品加标1mg/kg）

图5 葵花籽油样品空白和样品加标的TIC谱图

（上图为样品空白，下图为样品加标1mg/kg）

六、实验数据

1、标准曲线数据

橄榄油基质中3-MCPD、2-MCPD、Gly的标准曲线和相关系数见下表：

表4  3-MCPD、2-MCPD、Gly的标准曲线

注意事项

1.标准溶液浓度需根据标品实际称样质量、标品纯度以及目标物折算系数进行具体计算。

2.可选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

2、加标回收率数据

橄榄油、大豆油、菜籽油和葵花籽油样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量见下表。

表5  不同植物油基质的3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量

注：1、N.D表示未检出。

       2、表中缩水甘油酯含量的计算均校正了3-氯-1, 2-丙二醇酯的转换影响。

橄榄油、大豆油、菜籽油和葵花籽油样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率数据见下表。

表6  不同植物油基质的加标回收率数据（n=6）

注：表中缩水甘油酯含量的计算均校正了3-氯-1, 2-丙二醇酯的转换影响。

数据计算注意事项

1.2-氯丙醇酯的内标建议选择D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸双酯；

2.缩水甘油酯是通过前处理转换为 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）进行上机检测；

3.样品中缩水甘油酯的计算需扣除3-氯-1, 2-丙二醇酯转换生成的缩水甘油（Gly）的影响，而转换量是通过同位素内标13C3-3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸双酯（13C3-3-MCPD-PP）转换为同位素标记的13C3-Gly进行计算得到。

4.根据标准要求，建议样品中Z 终氯丙醇酯和缩水甘油酯的含量需校正加标回收率。

七、实验结论

使用安谱实验标准品和相关耗材，参照国际标准“ISO 18363-4:2021 Animal and vegetable fats and oils - Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS - Part 4: Method using fast alkaline transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol by GC-MS/MS”和国标征求意见稿“GB 5009.191-×××× 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定 第二篇第 一法”，对快速碱水解条件进行优化，使用同位素内标法进行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-115%之间，RSD均小于10%。该方法操作简便，快速，稳定，能够很好的满足植物油基质中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。

八、实验中所用到的耗材