食品中氯丙醇酯、缩水甘油酯测定的整体解决方案Ⅲ—— GB 5009.191-2024 第二篇第三法

称取同一试样两份于 A、B 管中，加入氘代氯丙醇酯同位素内标，用氢氧化钠-甲醇溶液进行酯键断裂反应，3-氯-1, 2-丙二醇酯（3-MCPDE）、2-氯-1, 3-丙二醇酯（2-MCPDE）和缩水甘油酯（GE）分别转化为游离态 3-MCPD、2-MCPD、缩水甘油；试液经中和、净化和苯基硼酸衍生后，以气相色谱-串联质谱仪检测。

B 管样品加入酸化溴化钠溶液中和后，GE 水解生成的缩水甘油转化为稳定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD），不影响氯丙醇酯的计算，B管用以测定试样中 3-MCPDE、2-MCPDE 的含量；A 管样品经酸化氯化钠溶液中和后，GE 水解后生成的缩水甘油主要转化为 3-MCPD，测定得到的 3-MCPDE 值为试样中 3-MCPDE 和缩水甘油酯（GE）之和，由 A 管和B 管 3-MCPDE 含量的差值，再乘以 3-MCPDE和GE 的折算系数，得到试样中 GE 的含量。

实验用到的标准品信息见下表：

表1 标准品信息

2.1 标准品溶液配置

氯丙醇酯混合标准中间液（10 μg/mL）：分别准确移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6个月。

氯丙醇酯混合标准工作液CaL I（2 μg/mL）：准确移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混标中间液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

氯丙醇酯混合标准工作液CaL II（0.2 μg/mL）：准确移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合标准工作液I，用甲苯定容至10 mL。临用现配。

缩水甘油酯标准中间液（10 μg/mL）：准确移取1 mL 100 μg/mL 缩水甘油酯标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6个月。

缩水甘油酯标准工作液CaL I（2 μg/mL）：准确移取1 mL 10 μg/mL 缩水甘油酯标准中间液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

缩水甘油酯标准工作液CaL II（0.2 μg/mL）：准确移取1 mL 2 μg/mL 缩水甘油酯标准工作液I，用甲苯定容至10 mL。临用现配。

内标混合标准工作溶液（D5-3-MCPDE:1μg/mL，D5-2-MCPDE:1μg/mL）：分别准确移取0.2 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE和D5-2-MCPDE标准溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

2.2 标准曲线配制

按照下表所示，分别配制氯丙醇酯标准曲线和缩水甘油酯标准曲线。加入甲苯、叔丁基甲醚（tBME）、内标工作溶液和相应的混合标准工作溶液，按照“样品前处理”进行操作，上机检测得到标准曲线。

表2 氯丙醇酯标准曲线的配制

（B管，加入酸性溴化钠）

表3 缩水甘油酯标准曲线的配制

（A管，加入酸性氯化钠）

标准品配制注意事项：

1、氯丙醇酯浓度均以对应的氯丙醇计，缩水甘油酯浓度以缩水甘油计，定量计算中需特别注意。

2、如使用纯品型标品，需注意计算标品的纯度和对应的折算系数。建议选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

3、注意区分AB管，氯丙醇酯标曲加入溴化钠溶液，缩水甘油酯标曲加入氯化钠溶液；内标混合标准工作溶液均需要加入。

试剂配置：

硫酸水溶液（25%）：将25 mL硫酸转移至含有50 mL纯水的100 mL容量瓶中。用纯水稀释至刻度线并混匀。

酸性溴化钠水溶液（600 g/L）：称取 60 g溴化钠，加水溶解后转移至100 mL容量瓶中，加入3.5 mL 25%硫酸溶液，用水定容至刻度，混匀。

酸化氯化钠水溶液（200 g/L）：称取 20 g 氯化钠，加水溶解后转移至100 mL容量瓶中，加入3.5 mL 25%硫酸溶液，用水定容至刻度，混匀。

氢氧化钠-甲醇溶液（0.35 mol/L）：称取1.4 g氢氧化钠，加入甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，转移至塑料瓶中，储存于10℃下。临用现配。

苯硼酸溶液：称取适量苯基硼酸，溶于无水乙醚，配制成饱和溶液，混匀。

乙醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙醚和石油醚各 100 mL，混匀。

乙醚-乙酸乙酯溶液（6+4）：量取 60 mL 乙醚和 40 mL 乙酸乙酯，混匀。

1%乙二醇溶液：移取 100 μL乙二醇，加乙酸乙酯定容至 10 mL，混匀。

试样提取：

准确称取两份婴幼儿配方奶粉试样0.5 g（精确至 1 mg）于两支40 mL玻璃螺纹样品瓶中（A、B管），分别准确加入100 μL混合内标工作液（1 μg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，涡旋混匀，再加入1 mL氨水，盖塞涡旋混匀，在65℃±5℃水浴下振荡30 min，取出后冷却至室温。加入3 mL乙醇，涡旋后加入5 mL乙醚，振摇5 min，然后加入5 mL石油醚，继续振摇5 min。待溶液静置分层后，取上层溶液于40 mL玻璃样品瓶中；再加入乙醚和石油醚各5 mL，重复萃取1次，合并有机相于40 ℃下氮吹浓缩至干，用2 mL乙醚-石油醚溶液（1+1）淋洗样品瓶内壁，将洗液转移至8 mL玻璃螺纹样品瓶中，于40 ℃下氮吹至干，供碱水解。

碱水解（酯键断裂反应）：

向提取脂肪样品中加入100 μL甲苯、200 μL叔丁基甲醚（tBME）。涡旋混匀30 s，10°C水浴冷却7 min。加入200 μL于10℃±1℃下冷却好的 0.35 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，涡旋混匀，于10℃±1℃下水解反应7 min。结束后立即于A管、B管中分别加入酸化氯化钠溶液、酸化溴化钠溶液各600 μL终止水解反应，涡旋，放置5 min。

于上述A、B管中和后的水解液中各加入600 μL正己烷，涡旋30 s后，静置待分层后弃去正己烷液，再加入正己烷重复萃取一次。若分层不理想，可以2000 r/min的速度离心3 min，下层水相供衍生用。

试样净化：

在净化的水溶液中加入0.5 mL无水乙醚-乙酸乙酯（6+4），涡旋10 s，取上层溶液于装有约0.3 g无水硫酸钠的离心管中，涡旋，再加入0.5 mL无水乙醚-乙酸乙酯（6+4）重复萃取操作。

衍生化反应：

合并2次萃取液，向净化液中加入30 μL苯基硼酸溶液，涡旋30 s后，加入30 μL 1%乙二醇溶液，涡旋，静置分层，必要时可离心使分层彻底，将溶液转移至装有约0.3 g无水硫酸钠的玻璃样品瓶中，涡旋混匀10 s，提取液过0.22 μm的疏水性PTFE针式滤器后供气相色谱-串联质谱仪进行测定。

前处理注意事项：

1、0.35 mol/L甲醇钠溶液建议存放在4℃条件下，建议至少存放2h以上，临用前拿出；

2、10°C低温酯交换反应时需尽量将整个螺纹瓶浸泡在水中，以保证螺纹瓶内温度稳定；

3、前处理过程中尽量避免使用塑料耗材，可使用玻璃螺纹瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手动进样针等耗材，建议进行方法空白实验监控过程本底情况；

4、建议使用疏水性PTFE针式滤器进行过滤；

5、注意区分AB管，B管加入溴化钠溶液用于检测3-MCPDE和2-MCPDE的含量，A管加入氯化钠溶液用于校正计算GE的含量。

仪器维护注意事项：

1、随着进样次数的增加，仪器轻微污染，目标物保留时间可能发生偏移；

2、该实验对仪器污染比较严重，仪器受到严重污染后，可能导致目标物响应降低、分离度变差等情况，需注意仪器的清洗维护，包括进样针的清洗，离子源的清洗，色谱柱的老化等；

3、如仪器配制程序升温进样口和反冲功能，可明显降低对仪器的污染程度。

4、建议色谱柱加装2m 相同固定相的预柱，定期对预柱进行更换，可延长色谱柱的使用寿命。

6.1 标准曲线数据

在加入酸性溴化钠溶液的B管标准样品中，以氯丙醇酯的质量(以醇计)为横坐标，以氯丙醇酯与其对应内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。

在加入酸性氯化钠溶液的A管标准样品中，计算 3-MCPD 与内标 D5-3-MCPD 的峰面积比值，通过 3-MCPD 的标准工作曲线（B管标准样品得到）计算得到A管标液中 3-MCPD（由缩水甘油酯标品转变而来）的质量。以 GE 的质量（以缩水甘油计）为横坐标，GE 转化后形成的 3-MCPD的质量为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线斜率的倒数（1/a）即为 3-MCPD 增加量折算成 GE 含量的系数t。

表5 标准曲线

6.2 加标回收率数据

本次实验方法空白未检出氯丙醇酯和缩水甘油酯，奶粉样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量分别为0.040、0.024、0.006 mg/kg。

奶粉样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的加标回收率数据见下表。

表6 奶粉基质的加标回收率数据（n=3）

数据计算注意事项：

1、本实验3-氯丙醇酯使用D5-3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸双酯作为定量内标；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸双酯作为定量内标；

2、缩水甘油酯最终含量以缩水甘油计，因此其含量不是简单的A、B管的3-MCPD差值，需要乘以折算系数；

3、基质样品通常含有本底，回收率均为扣除本底后计算得到。

使用标准品和相关耗材，参照国标《GB 5009.191-2024 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定》第二篇第三法，碱水解方法，使用氘代同位素内标法进行定量，AB双样校准缩水甘油酯含量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-110%之间，RSD小于10%。该方法操作简便快速，能够很好的满足奶粉基质中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。