气相色谱质谱法进行小儿遗传代谢病的快速筛查

【概述】

婴幼儿遗传性代谢病种类繁多，临床表现常常是非特异性的，且多无明显的神经系统定位体征，只凭临床表现往往很难诊断。医学检测技术的不断完善及提高，对婴幼儿遗传性代谢疾病的研究产生了很大的推动作用。气相色谱-质谱（GC-MS）检测技术作为化学诊断方法，首先由K-Tanaka于1966年应用于代谢性疾病的诊断，从1992年起该方法经过多次改进，目前用此方法同时筛查氨基酸、有机酸、糖代谢异常及脂肪代谢紊乱等一百多种疾病。本文采用赛默飞世尔科技气质联用仪建立了婴幼儿遗传代谢病的快速筛查方法，方法准确，敏感性高，特异性强，是筛查遗传性代谢疾病的有效手段。

【实验/设备条件】

色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；

柱温：60℃（2 min），10℃/min到220℃（3 min），15℃/min到325℃（5 min）；

进样模式：不分流进样，不分流时间：1min，

进样量：1 µL；

进样口温度：250℃；

载气：高纯氦气（99.999%），恒流模式，1.0 mL/min；

离子源温度：280℃，传输线温度：300℃，全扫描模式检测，扫描范围50-550

【实验/操作方法】

标本收集：采用干燥洁净的容器采集研究对象的新鲜尿液，本院样本直接分装到EP管，-20℃保存；外院样本在浸透尿液收集专用滤纸片后，于干燥避光处阴干，密封后邮递（耗时3-5天），寄到实验室后-20℃保存。

尿素酶预处理：取100µL尿液或尿滤纸片提取液，加入30µL尿素酶，37℃孵育30min。

上样前处理将标准品溶液或经过尿素酶处理的尿液样本，加入内标十七烷酸（200ppm）及无水乙醇1000µL，充分混匀，13000rpm高速离心5min，将上清液移入色谱进样瓶，高纯氮气吹干，残余物加入100µL BSTFA+TMCS（99 : 1），90℃孵育40 min，进行三甲基硅烷化衍生化处理。待GC-MS分析。

【实验结果/结论】

按上述条件对尿液样品进行前处理和气质联用仪分析，检测的化合物见表1。以各化合物的峰面积与肌酐的峰面积比值为判断依据，超出正常值则视为异常。

表1.检测的所有化合物的名称、保留时间

利用气相色谱-质谱法对遗传性代谢病（IMD）高危儿进行尿液化学分析，结果411例IMD高危儿中检测出代谢异常269例（65.5%），其中确诊IMD19例（4.6%），包括甲基丙二酸血症15例；丙酸血症、高苯丙氨酸血症、尿素循环异常和焦谷氨酸尿症各1例；疑似IMD22例（5.4%），包括乳酸血症13例原发性甘油尿症5例，脂肪酸代谢异常4例，Citrin缺陷症、络氨酸血症、半乳糖血症、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、枫糖尿症各1例；其他代谢异常228例蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰络氨酸、琥珀酸、双羧酸（55.5%），表现为尿乳酸、蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰络氨酸、琥珀酸、双羧酸水平以及丝氨酸/苏氨酸比例异常等。

图1为实际样品的检测全扫描的总离子流图。

图1.尿液检测结果总离子流图（上图为正常情况的尿液，下图为甲基丙二酸（9.28min）血症患儿尿液的检测谱图）

Tracefinder软件可以方便的给出目标物与肌酐的峰面积比值，如图2所示。每个化合物与肌酐的峰面积比值（response ratio）列在计算结果中。该软件还可以同时对化合物进行定性确认，如图3所示，目标物的定量离子和定性离子的提取离子谱图分别列出，离子丰度比也都显示在图上。样品中目标物的全扫描谱图与参考物的全扫描谱图对比显示在右下方，可帮助我们对目标物进一步定性确认。

图2. Tracefinder软件计算结果

图3. Tracefinder软件定性结果浏览

结论

利用赛默飞世尔科技全新一代气相色谱质谱联用仪进行小儿遗传代谢病的筛查完全可行。尿液经尿素酶处理后，衍生用气质联用仪分析，Tracefinder软件可以直接给出需要的比值结果，操作简单方便。该方法用于411例IMD高危儿尿液筛查，筛查结果检测出代谢异常269例。该方法准确，敏感性高，特异性强，是筛查遗传性代谢疾病的有效手段。

【仪器/耗材清单】

仪器

ThermoScientificTMISQ单四极杆气质联用仪，包括：

-TRACE 1310气相色谱，配分流不分流进样口

-ISQ LT单四极杆质谱

- AS1310自动进样器

Thermo ScientificTMTraceFinder 3.1数据处理系统

恒温干燥箱、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪（ThermoScientific）

耗材

色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）（Thermo Scientific, PN 26098-1420）（Thermo Scientific）

试剂与标准品

乙醇：色谱纯(Thermofisher)；

衍生试剂BSTFA+TMCS(99 : 1)

尿素酶

十七烷酸

【参考文献】

[1]彭薇,张万巧,封志纯.气相色谱-质谱法检测遗传代谢性疾病高危患儿.临床儿科杂志2014 (09)