气相-三重四极杆质谱分析食品与饲料中二恶英

【概述】

二恶英（PCDD/Fs）是包括多氯二苯并二恶英（PCDDs）和多氯二苯并呋喃（PCDFs）在内的一类剧毒有机化合物，主要通过垃圾燃烧或作为生产有机氯农药等特定化学物质的副产物而产生。二恶英可进入食物链，并长期存留从而产生生物累积。人类食用受污染食物是二恶英的主要暴露途径。美国环境保护署认定即使仅暴露于背景值水平的二恶英，仍可能使人类罹患癌症。因此，极ng确检测并定量环境中，尤其是食品和动物饲料中的二恶英至关重要。

欧盟立法通过气相色谱-高分辨质谱联用（GC-HRMS）对污染样本中的二恶英进行确证和定量的方法被认为是此类检测的“金标准”。随着近年来气相-三重四极杆质谱联用技术（GC-MS/MS）的不断突破，GC-MS/MS已可实现兼顾高灵敏度和高选择性。上述进展使得GC-MS/MS成为控制食品和饲料中二恶英Z高含量水平的又一有力工具。4

根据即将生效的欧盟新法规中规定，除了之前法规中有关GC-HRMS方法的标准外1,3，使用GC-MS/MS技术确证二恶英时，要求仪器必须满足下列性能指标：4

1.每个四极杆的分辨率都不得低于单位质量分辨率（单位质量分辨率定义为能够区分相差一个质量单位的两个质谱峰的Zdi分辨率）。

2.对于所有标记或未标记的分析物质的检测均需有两个特征母离子，每个母离子对应特定碎片子离子。

3.实测离子对相对离子强度与理论值偏差不得超过15%（校正标准物质平均值），以此确认串联质谱状态稳定，尤其是每个分析物质裂解过程中的碰撞能量和碰撞气体压力。

【实验/设备条件】

表1.气相色谱和进样器参数设置

依据即将生效的欧盟对二恶英检测的指标要求，测试中每个四极杆的分辨率均设置为单位分辨率（表2）。

表2.质谱参数设置

TSQ 8000 Evo通过采用电子电离源（EI）电离，在串联质谱模式下工作。数据采集过程中，根据欧盟针对二恶英GC-MS/MS检测的指标要求，每个化合物分别进行两个离子对的选择性反应检（SRM）。数据通过智能定时扫描（timed-SRM）模式确保每个通道的离子流色谱峰不少于12个扫描点。每对离子对及其碰撞能量的优化均由软件中的全自动SRM离子对优化（AutoSRM）功能自动优化完成，具体结果见表3。

数据处理应用ThermoScientific™TargetQuan 3.1软件完成，该软件专为日常环境中持久性有机污染物（POPs）常规定量分析而设计，可处理MS、MS/MS以及HRMS数据。

表3.天然及13C标记的二恶英类化合物的离子反应参数及碰撞能量

数据处理

原始数据通过TargetQuan软件完成处理过程，该软件可使用同位素稀释法对持久性有机污染物（POPs）进行分析。

软件基于相对响应因子（或平均响应因子），结合毒性当量因子（TEFs）自动计算出毒性当量（TEQs）并得出总毒性

当量。

【样品提取】

天然及13C标记的二恶英类化合物均来自Wel领tonLaboratories Inc.™。以下食品及饲料提取样本由西班牙国家研究委员会（CSIC）下属环境评估与水质研究所提供：三份干燥鱼类样本（之前曾用于实验室内部其他研究），一份饲料样本（内部标准物质）及一份奶粉样本（认证标准物质）。饲料基质样本的提取和净化通过PowerPrep™固相萃取系统

完成，奶粉和鱼样本则通过多层硅胶、碱性氧化铝柱以及活性炭柱依次手动过滤完成。

【实验/操作方法】

本文评价了Thermo Scientific™ TSQ 8000™ Evo三重四极杆GC-MS/MS用于分析二恶英类化合物的性能表现。为此，实验中采用标准溶液及食品、饲料样本来评估仪器性能是否符合新的二恶英测试指标要求。同时，比较了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与GC-HRMS测试相同食品、饲料提取物的测试结果。

【实验结果/结论】

Timed-SRM是一种完全不同于之前“经典”的分时间段进行方法设置的分析手段，它使目标化合物的数据采集设定于已知化合物色谱保留时间附近的一段特定窗口内，而不是一个较宽的时间分段内。这样，每个目标化合物在分析检测器中的驻留变得GX，极大地提高了仪器灵敏度，降低了方法检测限。此外，通过使用timed-SRMs还可分别检测临近出峰的同分异构体，例如六氯代二苯并对二恶英/呋喃类化合物（HxCDD/Fs）。图1为应用timed-SRM与分段式SRM对灵敏度影响的比较。

图1.与分段式SRM相比，timed-SRM模式对灵敏度提高比率（%）。以上数据通过比较每个二恶英类化合物的峰高（每秒计数）而得。

从色谱上实现二恶英类同分异构体的有效分离是以123478-HxCDF与123678-HxCDF两峰之间峰谷高度小于25%为标准的。1本实验中二恶英类化合物的色谱分离通过Zdi浓度的标准溶液（EPA1613- CLS）评估。该溶液含0.1pg/µL TCDD/F、0.5 pg/µL PeCDD/F - HpCDD/F和1.0 pg/µL OCDD/F。所有天然及13C标记的待测物均检出，且峰形良好（图2），所有HxCDF同分异构体间峰谷高度均不超过5%。

图2.Zdi浓度天然二恶英标准样品的色谱分离（括号中的浓度单位为pg/µL）。每个化合物仅展示一个SRM通道（定量离子）。

图3.经GC分离，123478-HxCDF与123678-HxCDF两峰之间的峰谷高度小于5%

达到期望的检测水平

对于二恶英检测，Z重要的一点就是达到期望的灵敏度。作为一个确证的方法，Zdi定量限（LOQ）应约为Z高限量的五分之一。1, 3, 4通常来说，考察仪器分析二恶英的灵敏度主要考虑Zdi检测限（LOD）和Zdi定量限（LOQ），而对于磁质谱，上述参数则通过信噪比（S/N）值计算（LOD信噪比值为3，LOQ信噪比值为10）。

通过GC-MS/MS的MS/MS模式采集的数据通常没有或只有很低的噪音，因此需要重新考虑LOD和LOQ的计算方法。假如由于技术原因，无法获得可信的信噪比值来计算上述参数，那么计算每个化合物的LOQ应根据Zdi浓度点（例如CSL）来计算，同时参考内标（回收率应在60-120%之间）、离子比例丰度以及色谱峰的情况。4所以，LOQ应通过Zdi浓度标样（CSL）以及三个相应稀释标准溶液的多次重复进样（n=10）测试来确定。

图4.根据二恶英一系列的稀释标准溶液重复进样结果计算的LOQ。数据表明，每个待测物LOD浓度的离子比例和响应因子均符合限定要求。

每个化合物的LOQ计算均考虑了相关自由度的t检验值（99%置信），各化合物浓度以及%RSD。结果表明，二恶英类化合物的LOD在0.01-0.05 pg/µL之间，相当于CSL的1:5和1:10的稀释液（在此浓度水平，离子比例和响应因子偏差均在±15%以内；13C标记的内标化合物回收率在60-120%之间）（图4）。

     Z终实验结果证明，TSQ 8000 Evo GC-MS/MS可对二恶英实现亚飞克级的检测和确证，完全符合新的欧盟规定要求。3

线性响应

二恶英的定量主要是基于同位素稀释法和响应因子校正来计算的。其中，所有标准样品的响应因子均通过外标曲线平均而得。1, 5平均响应因子%RSD是通过样品测试序列开始和结尾时测试的两条含六个测试点的标准曲线计算而得。所有结果%RSD在1.2-8%之间，完全符合EPA关于不得大于15%的限定要求5（表4）。

表4.二恶英类化合物的标准曲线线性（每条曲线六个测试点）。表中展示了每个天然二恶英化合物的平均响应因子准确度（%RSD）。所有数据来自测试样本序列开始和结尾时测试的两套标准曲线。

峰面积重现性

17种二恶英的峰面积精密度考察是通过对Zdi浓度标准溶液（CSL）多次重复进样测试（n=16）进行的。结果表明所有化合物的%RSD值均低于所规定Zda15%的限值，其中，偏差Zda的为2378-TCDD（8.3%），偏差Z小的为12378-PeCDD（3.2%）（图5）。

离子比例

样品测试过程中还测定了17种二恶英各自的离子对离子比（IR），并将测定值与标准物质的离子比例测定值（标准样本CSL-CS4的平均值）做比较。测试结果表明，样本中所有待试物质的IR与标准物质IR偏差均小于15%，符合欧盟对二恶英测试的规定标准4（图6）。

图5.标准曲线Zdi浓度点（浓度范围0.1-1.0 pg/µL）重复进样（n=16）的峰面积重现性。虚线标明Zda容许偏差范围为15%。

图6. 17种二恶英在样本提取物中的离子比例与标准样品（CSL-CS4）计算得出的平均离子比例值比较

样本提取物中的二恶英定量

进行二恶英定量测试的样本提取物是由巴塞罗那的CSIC制备的。在实验色谱条件下所有作为空白对照的基质样本中均未发现明显的基质干扰。图7为2378-TCDD的离子流色谱图。

通过测试每个样本，计算出样本中的二恶英类化合物各单体含量（单位为WHO-PCDD/F-TEQ pg/g），并与应用GC-HRMS测试相同样本所获数据进行比较。从结果来看，TSQ8000 Evo与GC-HRMS测试所得的数据结果较为一致（图8-图10）。

图7. 2378-TCDD与其内标13C-2378-TCDD在鱼（a）、饲料（b）和奶粉（c）样本中的提取离子流色谱图。图中所标的为样本中的化合物浓度（pg/g）。

图8.饲料样本中各二恶英类化合物分别通过TSQ 8000 Evo和GC-HRMS测试所得含量（TEQ pg/g）比较。

图9.奶粉样本中各二恶英类化合物分别通过TSQ 8000 Evo和GC-HRMS测试所得含量（TEQ pg/g）比较。

图10.鱼样本中各二恶英类化合物分别通过TSQ 8000 Evo和GC-HRMS测试所得含量（TEQ pg/g）比较。

比较TSQ 8000 Evo和磁质谱测试数据计算出每个样本中的总二恶英含量值，偏差不超过5%（图11）。每种基质样本中的二恶英Zda限值（ML）和处置限值（AL）亦被标出。2

Z-Score结果

为了检查TSQ 8000 Evo GC-MS/MS测试结果的准确性，对所有鱼样本进行了Z-Score检验（这些样本曾用于实验室内部其他测试）。通过每个样本的公议值（例如总二恶英含量值）、测定值及相应的标准偏差值进行检验计算。检验结果显示，通过GC-MS/MS测试的所有鱼样本数据的Z-Score值均在±2限值以内，平均值为-0.8（图12）。

图11. TSQ 8000 Evo测试各样本中总二恶英含量值与GC-HRMS测试值偏差（%）。

图12.鱼样本的Z-Score通过将公议TEQ值的±20%作为目标标准偏差值进行计算。

结论

综上所述，本次实验证明TSQ 8000 Evo GC-MS/MS是二恶英常规分析的有力工具，完全符合即将生效的欧盟法规对于二恶英在食品和饲料中的确证要求。

本次测试结果充分展示了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS作为一台高灵敏度和高选择性的仪器，可以完全胜任食物和饲料中二恶英的检测和确证工作。

TSQ 8000 Evo GC-MS/MS搭配TRACE 1310气相色谱仪和TargetQuan 3.1数据处理及报告软件可系统化解决复杂样本中的二恶英分析问题。

仪器在测试标准样品和实际样品提取物时均展示出了出色的重现性、线性、灵敏度和选择性。

基质样本中二恶英的TEQ计算值与磁质谱一致，充分证明了本仪器系统对于二恶英常规确证分析的可靠性。

【仪器/耗材清单】

仪器

TSQ 8000 Evo GC-MS/MS搭配TRACE 1310气相色谱仪

Thermo Scientific™TriPlus™ RSH自动进样器

耗材

Thermo Scientific™TraceGOLD TG-5SilMS毛细管柱（60 m×0.25 mm I.D.×0.25µm film）