GC-MS/MS分析在受体敏化天然活性香料成分的应用

【概述】

香辛调料是所有传统烹饪食物制品中的常用成分。长期以来，香料也一直用于传统中药（TCM）中。除此之外，由于其可产生即时生理刺激作用，现代人还将香料的活性成分用于各类个人防卫产品和执法产品中，如辣椒喷雾剂。在这些活性成分中，有许多成分与特异性受体相互作用并调节人体[1]的感官机制。这些受体可对多种天然和合成化合物引起的化学刺激作出响应。当受体激活时，神经信号转化为痛苦的灼烧感，也就是人们食用辣味菜肴时的感受[2]。受体敏化和活化可由多个天然化合物和许多其他化合物引起，包括辣椒素、胡椒碱和百里酚。

具有独特、强烈的味道。由于其具有KJ性，也将其用作家用护理产品中的KJ剂。反式肉桂醛（CAS 104-55-2）是肉桂树和其他樟属类树皮中存在的天然成分，并赋予肉桂粉典型的味道和气味。众所周知，肉桂醛常用作调味剂，但也用作杀真菌剂和KJ剂[3]。在此讨论肉桂醛是因为其常在辣椒喷雾剂产品中用作香味组分。

本应用文档介绍了香料提取物的GC-MS/MS分析方法，并将其作为天然活性香料成分中代表性成分辣椒素、胡椒碱、百里酚和肉桂醛定量测定的高选择性分析工具。

【实验/设备条件】

图1.配置TRACE 1310 GC和TriPlus RSH自动进样器的TSQ 8000系统

TSQ 8000软件套件中包含独特的MS/MS方法开发工具AutoSRM，仪器的采集方法使用该工具优化。该AutoSRM方法开发通过对标准溶液样品自动进样，自动测定保留时间、选择两对Z适合的母离子和子离子，并优化**灵敏度所需的碰撞能量。该程序运行高度自动化，并基于定时SRM模式提供SRM采集方法。

选择定时SRM模式时，不需要进行繁琐的手动检索，也不需要设置以往三重四极杆系统所要求的扫描片段。定时SRM模式通过设定化合物保留时间前后一段时间的窗口进行扫描，该窗口的时间可由用户自定义。AutoSRM处理一旦完成，则立即使用表2中所示生成的采集方法分析样品。

表1. TRACE 1310 GC和TSQ 8000 MS/MS的方法参数

图2. TRACE 1310 GC方法设置SSL进样器

【实验/操作方法】

样品的测定

活性化合物辣椒素和二氢辣椒碱洗脱的保留时间仅有微小的差别。若要在低浓度水平下进行可靠的峰积分（得到低

RSD值），峰必须得到良好的分离且无拖尾（图3）。研究发现，使用不同的GC色谱柱时，色谱柱去活的质量、色谱柱老化和基质沉积对辣椒素和二氢辣椒碱的峰形和定量重现性均会产生不利的影响。此外，胡椒碱也受到了影响，而百里酚的峰形始终保持对称，显然不受逐渐活跃的色谱柱膜条件的影响。

为了维持进样口衬管和分析柱的惰性以完成对大量样品进行高精密度定量并得到可重现的结果，将分析保护剂加入分析物的提取液一起进样[4，5，6]。这类分析保护剂已应用于农药分析、一些活性成分和极性化合物的分析中。在所有实验中，将2 ppm浓度的山梨糖醇加入到提取物中。

图3.辣椒素和二氢辣椒碱分别从（A）一根短的15 m已去活毛细管柱上洗脱，浓度为100 ppb，（B）一根30 m含活性位点的色谱柱上，浓度为500 ppb，其得到的峰形差，信噪比低。两根色谱柱的尺寸均为0.25 µm膜厚，0.25 mm内径，不添加分析保护剂

图4.辣椒素和二氢辣椒碱的峰形，（A）不加分析保护剂和（B）加分析保护剂，两者均在10 ppb浓度下运行，采用图3中的30 m色谱柱

图5.百里酚校正峰10-1000 ppb

图6.α-甲基-反式-肉桂醛校正峰10-1000 ppb

图7.辣椒素校正峰10-1000 ppb

图8.胡椒碱校正峰10-1000 ppb

图9.低浓度范围10-200 ppb内的定量校正曲线

精密度

在重现性研究中，连续三天三次对一系列样品进行了测量，以相对标准偏差计算峰面积结果的精密度（RSD％）。在低水平校正点（Z高200 ppb）上测定了百里酚、α-甲基-反式-肉桂醛、辣椒素和胡椒碱的峰面积精密度。百里酚的RSD值在任意情况下均小于等于3%。该化合物受

GC系统中的潜在活性位点的影响较小。α-甲基-反式-肉桂醛、辣椒素和胡椒碱等活性化合物也呈现出优异的精密度数据，研究期间RSD介于0.5%-8%之间。在低浓度水平下，其他活性分析物的优异峰面积精密度是通过在分析提取物中加入分析保护剂来实现的。

连续三天，对实际使用的加标香料样品进行了测量，同时也计算测量值的精密度。表3中的峰面积数据表明加标量低于10 ppb。所有供试化合物三天内的重现性介于1-3％范围内。

【实验结果/结论】

上述方法采用TSQ 8000 GC-MS/MS系统为受体敏化的活性化合物如辣椒素、胡椒碱和百里酚的痕量分析提供了一种灵敏、精密的分析方法。使用山梨糖醇作为分析保护剂，可得到这些极性香料成分优异稳定的对称峰形。

分析保护剂可以减少较差的色谱峰形，并保持色谱峰的完整性，从而得到样品的对称峰形和非常稳定的结果，并具有优异的精密度。此外，自动峰积分更方便，峰面积增大，重现性得到了显著提高。

分析研究的所有化合物，特别是辣椒素、胡椒碱和百里酚，可以获得很高的信噪比，即使在10 ppb低水平下。

TRACE 1310 GC系统的优异重现性通过检测浓度远低于10 ppb的基质样品得到了证实。在所有检测浓度水平下（包括10 ppb低浓度水平），其精密度均低于10％ RSD。

【仪器/耗材清单】

Thermo ScientificTM TSQ 8000TM三重四极杆GC-MS/MS系统

Thermo ScientificTM TRACETM1310 GC仪器（含SSL Instant Connect™ SSL模块）

Thermo ScientificTM TriplusTM RSH 自动进样器

【参考文献】

1. Vriens, J., Nilius, B., and Vennekens, R., Herbal Compounds and Toxins Modulating TRP Channels,Curr Neuropharmacol. 6(1) (2008) 79-96.

2. Vriens, J., Appendino, G., Nilius, B., Pharmacology of Vanilloid Transient Receptor Potential Cation Channels,Mol. Pharmacol. 75 (2009) 1262-1279.

3. Ooi, L., Li, Y., et al, Antimicrobial Activities of Cinnamon Oil and Cinnamaldehyde from the Chinese MedicinalHerb Cinnamomum cassia Blume, Am. J. Chin. Med.34 (2006) 511.

4. Anastassiades, M., Maštovská, K., Lehotay, S.J.,Evaluation of analyte protectants to improve gaschromatographic analysis of pesticides, J. Chromatogr.A 1015 (2003) 163-184.

5. Mastovska, K., Lehotay, S.J., Anastassiades, M.,Combination of Analyte Protectants To OvercomeMatrix Effects in Routine GC Analysis of PesticideResidues in Food Matrixes, Anal. Chem. 77(24) (2005)8129-8137.

6. Li, Y., Chen, X., Fan, C., Pang, G., Compensation for matrix effects in the gas chromatography–massspectrometry analysis of 186 pesticides in tea matricesusing analyte protectants, J. Chrom. A 1266 (2012),

131-142.

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