文献分享：采用多种分析手段对SARS-CoV-2重组蛋白疫苗进行基于高分辨质谱的全面深入表征

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张晓夕

本文中展示了中检院单抗室最新发表在Analytica Chimica Acta杂志（IF=6.2）上，对SARS-CoV-2重组蛋白疫苗进行全面深入表征的研究结果。该产品包含多种翻译后修饰，如糖基化、脱酰胺和氧化等，异质性极高，单一技术平台无法实现对此类重组蛋白产品彻底、准确的表征，故整合多种理化分析技术进行产品表征就显得尤为必要。本文中展示了整合多种分离技术的创新串联高分辨质谱工作流程，包括超高效液相色谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC)、离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEX) 和成像等电聚焦毛细管电泳 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, icIEF)分别与高分辨质谱联用，首次对该SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗进行了全面、深入的表征。

本工作的一个突出亮点在于尖端 icIEF-MS 在线直联和 icIEF馏分收集技术对于揭示SARS-CoV-2重组疫苗电荷异质性的重要性。

研究人员首先对样品进行了还原/非还原条件下胰酶酶解，并分别使用Thermo Scientific? Q Exactive? Plus Orbitrap? 超高分辨质谱仪和Orbitrap Fusion? Lumos? Tribrid? 超高分辨质谱仪进行了液质联用肽图分析。使用Q Exactive? Plus Orbitrap? 超高分辨质谱仪的高能碰撞解离（High Energy Collision Dissociation, HCD）二级碎裂模式，由于HCD模式下糖链也会被打碎，对于没有切除N/O糖链的样品，肽图分析可达到89.5%的序列覆盖度。而使用Lumos? Tribrid? 超高分辨质谱仪的HCD二级碎裂触发电子转移/ 高能碰撞解离(Electron-Transfer/Higher-Energy Collision Dissociation, EThcD)二级碎裂模式，可以监控糖肽HCD碎裂后产生的糖链特征性碎片离子，随之对同一条糖肽进行EThcD二级碎裂，保留肽段上的完整糖链修饰，从而可以在肽图分析层面同时对糖肽序列、糖基化修饰位点和糖链分子量进行鉴定。

图2A和2B分别展示了EThcD二级碎裂得到的O-糖肽及高唾液酸化N-糖肽的二级谱图，证明了EThcD碎裂模式在糖肽分析中的独特优势。图2C展示了采用EThcD二级碎裂，鉴定到的N-糖基化位点及糖型分布情况，表1则对EThcD二级碎裂肽图层面鉴定到的O-糖糖链种类和相对含量与传统的液质联用检测荧光标记的O-糖链（UHPLC-FLD-MS）结果进行了对比，可见两种方法分别鉴定到的O-糖型趋势一致，但EThcD二级碎裂肽图分析可以在一针进样中同时获得糖基化修饰位点和糖型信息，糖型种类更为丰富，还可以获得未发生糖基化修饰的比例，这些都是质谱法相对于传统荧光标记法检测O糖链的独特优势。对于没有切除N/O糖链的样品，EThcD二级碎裂肽图分析可达到97.7%的序列覆盖度，仅切除N-糖链后，序列覆盖度可达99.7%，并且可以确定每段单体序列上分别有2个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点，完整蛋白上总共有6个N-糖基化修饰位点和3个O-糖基化修饰位点。

表1. EThcD 肽图分析与传统荧光标记法检测O糖链定性定量结果对比。左栏，EThcD 肽图分析法。右栏，传统荧光标记法。

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肽图分析结果初步揭示了N/O糖基化修饰导致的分子高度异质性。接下来，研究人员通过使用不同的糖苷酶，切除对应种类的糖链后，在Q Exactive Plus 质谱仪上进行非变性条件下完整蛋白分子量分析。非变性条件可减少蛋白电荷态，进而降低相邻质谱峰之间的互相干扰，从而获得更准确的分子量分析结果，但此技术对于质谱仪的灵敏度有较高要求。图3A-F展示了分别使用不同种类糖苷酶处理样品后，非变性条件完整蛋白分子量分析的结果。Orbitrap质谱平台兼具高灵敏度、高质量精度和高分辨率的优点为此类复杂样品的非变性条件下完整蛋白分子量分析提供高质量分析结果。由于样品中具有多个糖基化位点，将完整蛋白分子量分析与肽图结果相结合，可以得到蛋白上不同位点的糖链修饰分布情况。图3G展示了3个O-糖基化位点上不同糖型修饰的分布情况，可见排名前三位的组合依次为2xGalNAc-3SG + 1xGalNAc-6S-3SG (39.05%)，3xGalNAc-3SG(28.52%)和1xGalNAc-3SG+2xGalNAc-6S-3SG (19.86%)。

复杂的糖基化修饰导致此样品具有极高的电荷异质性。研究人员使用了尖端的iCIEF-MS直联技术，对该样品进行基于电荷异质性的分离，随后在线直联高分辨质谱测定每个电荷异构体的分子量。如图4A-B所示，没有切除糖链的样品经iCIEF分离后得到18个峰，每个峰中仍含有多个不同组分。图4C对peak1和peak2的原始谱图进行了对比，可见明显区别，图4D的解卷积结果对比进一步揭示了peak1和peak2的不同。得益于iCIEF技术对复杂样品的分离，以及Orbitrap超高分辨质谱平台的优异性能，不切除糖链即可对复杂糖蛋白进行完整分子量分析，从而得到详实且最接近样品原始状态的N/O糖基化修饰信息。

原文参考链接：

https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.342349

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