药用辅料分析与质量控制 ——UHPLC/Q-TOF结合PolymerStudio 软件进行吐温降解产物的研究

研究背景

近年来，由于辅料降解或辅料中含有的过氧化物活性杂质与 API 发生反应等造成药物质量风险的报道出现增加的趋势。吐温（学名聚山梨酯），是脱水山梨醇聚氧乙烯与脂肪酸酯化后产生的一系列混合物，是常用的药 用辅料，特别是在抗体等生物制剂中。已有很多文献报道关于吐温降解造成抗体制剂中形成可见异物或不溶性微粒的问题。

吐温有两个主要的降解通路：水解和氧化。吐温水解通常表现为酯化产物尤其是高酯化产物的减少，低聚合度聚氧乙烯（POE）的增加、游离脂肪酸以及其它不完全水解产物的产生。吐温的氧化降解常见于吐温 80，因为油酸中不饱和双键的存在，容易受到 pH 值和金属离子等因素的影响发生氧化，产生羟基化物、环氧化物、过氧化物等一系列氧化产物。根据特定的降解产物来推测解吐温的降解通路，并在药物开发阶段采取有针对性的控制策略对于药物制剂开发和质量控制很重要。

安捷伦与科迈恩以及中国医学科学院/协和医学院药物研究所合作建立了一套完整地针对吐温组成成分及其降解杂质的精细表征，通过 UHPLC-6500 系列  Q-TOF MS 液质联用仪，配合 PolymerStudio 聚合物分析软件和专用数据库，为制剂处 方筛选和工艺优化提供了有力武器。

图 1. 吐温及其降解杂质的全面快速分析方案

吐温水解

吐温降解初期的表现之一是亚类成分发生明显变化，这些变化通常由于吐温的水解产生，pH 值和酯酶的存在可能导致或加速吐温的水解，主要表现为高酯化成分减少、酯化度降低、聚氧乙烯（POE）等未酯化成分含量增加且聚合度降低等。

实验测试了吐温 20 在制剂酸性环境下不同时间点的精细组成变化情况：从未酯化区域看，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯异脱水山梨醇（PI）和聚氧乙烯脱水山梨醇（PS）的相对含量明显增加，并且随反应时间延长而继续升高，聚合度也有明显降低（可能与聚氧乙烯水解有关）。从单酯含量看，辛酸单酯、癸酸单酯和月桂酸单酯的相对含量变化较小，肉豆蔻单酯、棕榈单酯和油酸单酯的含量随着反应时间延长而明显降低。双酯及更高酯化度的化合物，随着反应时间延长，信号强度明显减小甚至消失。

图 2. 吐温 20 在酸性环境下不同时间点的 TIC

实验同时考察了针对吐温 80 的酯酶水解，观察到了未酯化成分 POE、PI 和 PS 含量的增加，聚氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯（PSTO）和四油酸酯（PSEO）相对含量的明显减少，并观察到了（异）脱水山梨醇母核水解的产物。另外，除了精细组成的变化，吐温水解直接表现为酯化度的降低，可以从 PolyPattern 软件分析报告中直接读出。本例中吐温 80 经过酯酶水解后，平均酯化度从 1.57 降至 0.71，而平均聚合度变化较小（从 21.38 微弱下降至 19.95），表明吐温 80 的酯酶水解，以高酯化成分水解脱油酸为主，POE 链几乎没有水解。

吐温的氧化降解及降解产物表征

吐温 80 因其脂肪酸链存在不饱和双键，在高温、光照和金属离子等影响下，可能发生一系列的氧化反应，生成脂肪酸链变化的氧化产物。中国医学科学院/协和医学院药物研究所张金兰老师课题组今年在 Anal. Chem. 上发表文章，详细探讨了吐温 80 的 32 类 348 种氧化杂质，优化了 UHPLC-Q/TOF 结合 AIM（全离子 MS/MS，All Ions MS/MS）的表征技术，建立了保留时间-结构特征鉴别模型，将高分辨质谱信息、同位素分布、特征碎片离子及保留时间模型应用于吐温 80 氧化产物的鉴定。

上述研究工作，已经同步写入 PolymerStudio 软件数据库，用于吐温 80 氧化产物的全面快速表征。下图展示了某生物制剂中吐温 80 氧化产物的相对含量分析，占比较高的氧化杂质分别为聚氧乙烯脱水山梨醇单羟基油酸酯（PSMH）、聚氧乙烯异脱水山梨醇单羟基油酸酯（PIMH）和聚氧乙烯异脱水山梨醇双羟基油酸酯（PIDH）。

图 3. 某生物药物中吐温 80 各个亚类氧化杂质的相对含量

特殊降解产物及未知物鉴定

在强降解等特殊实验中，我们可能观察到一些未知降解产物。这时可以利用 Q-TOF 的未知物鉴定能力，通过准确质量和同位素信息，推测未知物的分子式，再结合二级质谱特征碎片信息，推测未知物可能的结构。下图展示了在吐温 80 的强降解实验中，除了观察到 POE 含量增加，聚合度降低，还出现了一系列 POE 的氧化产物，可以利用高分辨质谱信息推测其分子式及可能的结构。

图 4. 吐温 80 强降解实验后 POE/PS/PI 的对比（右图）及推测的 POE 氧化产物的质谱信息（左图）

结 语

安捷伦 UHPLC-6500 系列 Q-TOF 质谱结合 PolymerStudio 聚合物分析软件，可以全面快速表征吐温及其常见降解产物，一方面有利于揭示吐温的降解途径并探究其可能的降解原因，另一方面可以全面探讨环境因素和存放时间等对吐温降解的影响，为制剂开发、工艺优化以及产品质量控制提供了有力的武器。