STAR Protocols | RTCA技术：SARS-CoV-2中和抗体高通量筛选和病毒逃逸鉴定的解决方案

在COVID-19大肆流行的当下，截至目前为止，全 球已超过5.6亿人次感染，并导致超过637万人死亡。因此针对SARS-CoV-2中和抗体的快速开发尤为重要。在抗体开发过程中，中和抗体筛选实验常用的细胞病变实验（Cytopathic effect，CPE），指由病毒感染引起的宿主细胞的活率和形态变化，主要观察的CPE包括细胞的肿胀皱缩，变圆，裂解，脱落，形成蚀斑和聚团等。传统的CPE检测通常依靠显微镜下的肉眼观察，数据记录困难。同时传统CPE数据分析需要经验丰富的研究人员进行人工鉴定，耗费时间精力，而且很难避免人为导致的主观判断差异。

安捷伦xCELLigence 实时细胞分析仪（Real-time cell analysis，RTCA）可灵敏的捕获到细胞活率和形态的变化，可在数天内持续跟踪病毒致CPE，体外单克隆抗体中和测定使用RTCA能够对病毒感染细胞中的CPE 进行高通量、定量动力学测量。

2022年6月17日，美国范德堡大学医学中心在CELL旗下的STAR PROTOCOLS杂志发表了题为“Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape”的研究方案论文。该文章为我们详细介绍了一种用于评估抗体中和的RTCA 方法，描述了如何评估单克隆抗体(mAb) 的中和效力，并鉴定对中和抗体逃逸的病毒突变体。在此之前，该团队已经应用RTCA作为高通量中和抗体筛选手段在多个顶 级期刊发表多个高水平文章。

该研究详细描述了基于 RTCA 的工作流程体外单克隆抗体对病毒的中和测定和鉴定表达SARS-CoV-2 刺突蛋白的可复制的重组水泡性口炎病毒(rVSV-SARS-CoV-2) 的逃逸突变体[1,2]（图1）。基于RTCA的中和作用检测是通过测量由病毒感染细胞单层引起的细胞阻抗变化，Z 终结果显示为细胞指数的变化（Cell index, CI）。

不局限于SARS-CoV-2病毒中和抗体的研究，该团队应用RTCA已经在埃博拉病毒、寨卡病毒、流感病毒和尼帕病毒中和抗体的识别和表征方面取得了很多优异的结果[3-7]。

在这一实验方案中，首先利用RTCA进行病毒滴定，梯度稀释rVSV-SARS-CoV-2病毒并在RTCA上进行Vero CCL81细胞的CPE实验，Z 终选择加入病毒后40h内达到完全CPE的1：160的稀释比例进行后续中和抗体实验（图2）。然后RTCA抗体的中和实验将需要测试的抗体以及对照抗体进行梯度稀释（图3.A），与病毒混合后加入到单层Vero CCL81细胞中在RTCA上进行实时监测，Z 终结果使用非线性拟合和可变斜率分析计算抗体的RTCA IC50值以呈现mAb的中和曲线（图4）。

该研究也同时描述了病毒变体筛选实验方案，与抗体中和实验不同，该实验使用10倍过量病毒，且单一浓度的抗体，同样应用RTCA进行长期的观察来区分病毒直接引起的CPE和中和抗体引起的延迟CPE以识别逃逸的突变病毒（图5.A）。为了验证逃逸的病毒，收集逃逸孔中的病毒，在随后的RTCA 实验中，不同mAb在高浓度（比饱和中和浓度高两倍）情况下重新评估分离的病毒，参见图5B。将逃逸的病毒分离并在六孔板中进行繁殖，后续进行病毒RNA提取以及建库进行测序，从而鉴定出病毒的突变位点。

总结：通过该方案，可以高效的鉴定出SARS-CoV-2的中和抗体，并快速的鉴定和分离出抗体逃逸的突变毒株。其中，RTCA作为一种高通量的技术不仅可以在48-72长时间实时监测抗体的中和，其结果与传统方法也高度一致[5]。

目前传统的病毒中和抗体的筛选方法多基于观察法，但是该方法费时费力，数据记录困难，特别不适用于高通量的筛选工作。安捷伦xCELLigence RTCA无需对细胞做任何标记就可以实时分析细胞的生长，全程自动检测病毒感染细胞的动力学变化，Z 大程度减少了手动样品处理，提升实验效率，准确性和重复性。其中xCELLigence RTCA HT 与xCELLigence RTCA MP 分别配备384 well和6*96 well的通量，满足高通量需求，简化筛选工作，同时保证数据的稳定输出。