应用文集｜肽谱分析“柱”力提高生物制药关键质量属性

肽谱分析是一种强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构基团的准确位置。由于重组蛋白质的一级结构或氨基酸序列是已知的，因此能够预测在使用酶（例如胰蛋白酶）酶解蛋白质时将生成的片段。胰蛋白酶通过水解赖氨酸或精氨酸，以及除脯氨酸以外的任何其他氨基酸之间的键将蛋白质分解成片段。使用这种方法，曲妥珠单抗将被分解成 62 种单独的片段，并且高分离度反相分离能够将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际峰值与分析软件预测的预期片段相关联。

不同蛋白质将产生不同的肽“指纹”，这些肽段具有不同的大小（从单个氨基酸和二肽到更大的多肽）并具有不同程度的疏水性。因此，推荐用于此类分离的色谱柱是表面多孔或全多孔颗粒填料的 C18 反相色谱柱。

今天，安捷伦将与你同行一起研究如何多方式高效率地进行肽谱分析。我们将分别从蛋白质解酶五部曲、反向色谱法、分离必备条件等部分为大家分类介绍如何从肽谱分析的不同样品制备方法出发，结合色谱柱的选择以及色谱条件，探索对于肽谱分析的影响。精 准定量全面鉴定蛋白质肽谱分析研究的完整工作流程及应用案例，进而“柱”力提高生物药行业关键质量属性。

入门指南篇

样品前处理对于成功的肽谱分析至关重要。这可能是一个耗时的过程，其中可能需要针对酶解的各种蛋白质优化多个步骤。对于肽谱分析样品体积较大的用户可能想要通过自动化提高速度并改善重现性。

使用三氟乙酸作为离子对试剂可获得更出色的峰形，并且 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱是该分离的理想选择。该色谱柱含有 120 Å 孔径的 Poroshell 颗粒，并提供优异的分离度和峰容量，且无需采用 UHPLC 仪器。对于使用质谱检测的应用，通常优先选择甲酸作为离子对试剂。在此类情况下，AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱将提供更出色的分离谱图。AdvanceBio Peptide Plus 也推荐用于需要采用较大的样品载样量以检测微量杂质的情况。对于亲水性极强的小分子肽，推荐使用 AdvanceBio 肽谱分析以实现更好的保留。

蛋白质解酶五部曲

处理蛋白质以增强肽谱分离在分析前，需要很好地了解蛋白质酶解的步骤，这有助于确保酶解过程完整、成功地进行，以及帮助您更自信地选择策略。通常情况下，酶解方法需要一套独立的开发方案，以提供充足稳定的样品进行 LC 进样。虽然酶解过程的优化有许多选择可以考虑，但还是需要遵循一些常用方法。蛋白质酶解可分为五个步骤，如表 1 中总结：(1) 样品前处理，(2) 选择裂解试剂，(3) 还原/烷基化，(4) 酶解过程，(5) 富集/纯化。

表 1. 蛋白质酶解的五个步骤

*更多详情请参考文末“码”上下载——肽谱分析应用文集5994-0037ZHCN

反相色谱法

在选择肽谱分析色谱柱和方法时，Z 终 往往是依据所分析的蛋白质和工作流程的目的而决定Z常用的肽谱分析色谱柱方法（特别是在生物制药领域）是反相色谱法 (RPC)。出色的分离能力及挥发性流动相（与质谱仪兼容）的使用，使得这种技术成为大多数多肽分离中的主要 HPLC 方法。其分离速度和效率均优于其他的 HPLC 分离模式，可谓是肽谱分析的“理想之选”图 1 显示了使用方法 A 和 B，通过 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统分离 NISTmAb 胰蛋白酶酶解产物得到的色谱图。选取 8 个峰用于后续的保留时间精度和峰容量计算。

图 1. 使用方法 A 和 B，通过 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统分离 NISTmAb 胰蛋白酶酶解产物得到的色谱图。选取 8 个峰用于后续的保留时间精度和峰容量计算

成功进行肽谱分离的必备条件

一般情况，需要很好地了解多肽特定的色谱柱要求，以及色谱方法开发过程来开发实用性 RPC 肽谱分析方法。虽然很多相同的色谱原则同时适用于多肽和小分子分离，但在优化多肽方法、获取可重现的稳定分离中，还是有许多条件特异性变量。色谱柱选择、色谱柱质量、流动相选择及检测要求均是肽谱分离的重要因素，可大大改善肽谱的质量。

图 2. AdvanceBio SEC 色谱柱

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色谱柱选择

为获取可靠、分离度良好的肽谱分离，其中Z重要的因素是选择合适的色谱柱。色谱柱孔径、填料类型和粒径、键合相化学性质和稳定性（化学床和填充床）在改善肽谱分离、优化策略和光谱分析中有着重要作用。对于多肽分离，首 选的色谱柱孔径范围为 100 Å–120 Å，而优化的固定相选择通常为 C18。虽然一些商业化色谱柱可针对多肽分离提供低至 60 Å 的孔径，但是这些色谱柱常用于较小肽段碎片或标准品的分析。同样地，一些较小的键合相碳链长度也在使用中，但这与特定的方法相关，在获取宽范围 的疏水性多肽保留时，实用性较为有限。

由于多肽的扩散系数较高，因此其分离的塔板数较小，适合于在较低流速下，使用更小直径的全多孔色谱柱材料。由此衍生出亚 2 µm 的填料，用以更高效的肽谱分析。但是目前，表面多孔色谱柱越来越多的使用于生物分离（尤其是在生物制药行业），因为这种材料解决了蛋白质和多肽的质量扩散问题。这些色谱柱的扩散路径更短，可在较高的线性速度下分离较大的分子，不会由于粒径的减少而出现系统反压增加的问题。图 3 所示为使用表面多孔色柱所得的快速高分离度肽谱示例。

图 3. BSA 的反相分离图，采用 Agilent AdvanceBio 肽谱分析 2.1 × 150 mm 色谱柱（安捷伦部件号 653750-902）。肽谱分析条件为 0.3 mL/min，40 °C，流动相为水（含 0.1% TFA）/乙腈 (0.08%)，线性梯度

色谱柱质量（多次运行间的重现性和稳定性）是维持肽谱分离重现性和稳定性的关键因素，有时会被忽略。反相多肽分离常在低 pH(pH < 3)、高温下(> 40 °C)进行。

肽谱分析依赖于色谱柱的可重现操作，以获取准确的指纹图谱和重复验证的方案。在为肽谱分析选择一种色谱柱时，整个决策流程中应优先考虑色谱柱质量。图 4 所示为具有优异可重现性的单克隆抗体胰蛋白酶水解物肽谱，在低 pH 和高温条件下分离，并进行了 LC/MS 分析。

图 4. 一种单克隆抗体胰蛋白酶水解物的五次重复进样，在 Agilent 1200 液相色谱系统与 6520 Q-TOF 的联用系统上使用 3.0 × 150 mm 的 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱（安捷伦部件号 653950-302）。分离条件为 0.3 mL/min，40 °C，流动相为水（含 0.1% FA）/乙腈（含 0.1% FA），梯度洗脱

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此外，本篇应用文集中还包含合成肽及其杂质的分析、对于用于肽谱分析的高通量蛋白质酶解，AssayMAP Bravo 平台支持自动化样品前处理。