应用文集｜鼎力相“柱”，步入「生物制药质量属性」的缤纷世界

生物治疗蛋白是一类高度复杂的分子。该生产过程中将产生许多不同的蛋白异构体，因此，确保此类产品的质量至关重要。这意味着需要确认产品的正确生产、任何杂质均得到鉴定和定量，并且对蛋白的效价进行测定。了解不同类型的杂质和各自的风险构成了关键质量属性 (CQA) 监测的基础。

本应用文集分别从滴度测定篇、完整蛋白质和亚基纯度篇、肽谱分析篇、氨基酸分析篇、多聚糖分析篇、聚集体篇和电荷异构体分析篇七个章节分别重 点介绍一些适用于不同方面 CQA 监测的 HPLC 应用，同时为可能涉及的不同类型检测中所需用到的液相色谱柱提供使用指导。

滴度测定

在生物治疗药物的生产过程中，滴度测定用于测量发酵液中目标蛋白的浓度。在以下两种重要的情况下，需要进行准确的滴度测定。第 一种情况是在克隆筛选过程中，仅选择那些提供足量目标蛋白的转染克隆细胞株。第二种情况是在发酵工艺的放大过程中监测目标蛋白质的浓度：细胞培养基条件的优化和Z 佳收获时间的确定依靠准确的滴度测定。

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完整蛋白和亚基纯度

反相色谱仍然是色谱工作者“武器库”中Z有价值的工具之一。这是一种广为人知的技术，依赖于分析物和固定相之间的疏水相互作用。对于完整蛋白，该技术使用有机溶剂作为流动相进行梯度洗脱。在这些条件下，分子很可能发生变性。这是一种灵敏的分析技术，因为样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白质的精确质量。

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肽谱分析

肽谱分析是一种强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构体的准确位点。由于生物治疗蛋白的一级结构或氨基酸序列是已知的，因此能够预测在使用酶（例如胰蛋白酶）酶解蛋白质时将生成的片段。胰蛋白酶通过水解赖氨酸或精氨酸，以及除脯氨酸以外的任何其他氨基酸之间的键，将蛋白质分解成片段。使用这种方法，曲妥珠单抗将被分解成 62 种单独的片段，并且高分离度反相分离能够将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰，与分析软件预测的预期片段相关联。

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氨基酸分析

确定蛋白质的氨基酸组成是一种成熟的技术，该技术通常与其他技术一起使用以确认正确的结构。在分析之前，通常利用酸水解使蛋白质水解成氨基酸。氨基酸也是用于制备生物治疗蛋白的细胞培养基中的关键成分。通常需要监测发酵反应期间各种氨基酸的消耗量，因此可以使用相同的色谱方法。

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多聚糖分析

糖基化是一种重要的翻译后修饰，因为多聚糖在蛋白质识别和生物治疗药物疗 效方面起着关键作用。生物治疗蛋白的生产需要采用哺乳动物细胞系。糖基化途径非常复杂，而且并非所有克隆都能产生所需的糖谱。监管机构认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹图谱提供了指导，包括使用特定的酶 PNGase F 切割 N-糖，用荧光试剂标记它们以提高检测灵敏度，然后使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 柱（通常与荧光检测器结合使用，但也可使用质谱）将它们分离。

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聚集体/片段分析

蛋白质经常容易由于环境条件刺激而发生聚集，形成二聚体和大分子量低聚物或高阶结构。这在生物治疗蛋白的生产中尤其成问题，因为目标蛋白要经受可能诱导聚集的多种条件。这些条件包括发酵过程中温度和浓度的变化，以及下游处理过程中 pH 和浓度的变化。甚至剪切力（来自叶轮叶片、搅拌器和其他工程设备）也可能导致与应力相关的聚集。聚集体，特别是分子量非常大的多聚体以至亚可见颗粒的存在，可能会对健康有害。因此，先决条件是量化和确定聚集水平，并予以限制。

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电荷异构体分析

由于存在带正电荷和带负电荷的氨基酸以及带负电荷的多聚糖（唾液酸），意味着大分子蛋白质作为多电荷物质存在，并且有几种副反应可导致净电荷变化。抗体抗原结合区内的异构体对功能的影响可能更为重大。

结语

Agilent AdvanceBio 色谱柱经过精心设计和制造，能够在分析高度复杂的生物治疗分子以及监测它们的纯度、效价和其他关键质量属性时为您提供可靠的结果。