提取组织器官RNA|净信多样品组织匀浆机实验案例

　　组织样品中RNA的提取实验：本实验的组织样品主要有小鼠的各个组织器官（如肝脏，肌肉，脂肪等）和人肿瘤标本（如结直肠癌，肺癌，乳腺癌）

　　1.首先要根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的TRIZOL液体，同时加入若干颗不锈钢柱。本实验室一般情况如下：（小鼠组织加入TRIZOL,结直肠癌标本加入TRIZOL）
　　
　　注意：
　　
　　a.用净信匀浆机进行匀浆处理时样品体积不要超过TRIzol体积10℅）
　　
　　b.需事先预冷试管座
　　
　　2.把加入样品,TRIZOL,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子，点击运行
　　
　　3.机器运行完毕后，打开盖子，拿出净信EP管仔细观察组织的研磨情况，如果没有明显的块状物，那就可以进入下一步实验步骤，如果没有完全打碎，还需要把EP管放入试管座中，继续匀浆。有些坚硬，或者脂肪含量高的组织（乳腺）可能需要稍微长一点的时间，时间可以依据组织实际的研磨情况来调整匀浆时间。
　　
　　4.和传统的TRIZOL提取RNA的方法一样,将匀浆样品在室温放置几分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
　　
　　5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡若干秒，室温放置几分钟。
　　
　　6.2-8℃10000×g离心十几分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
　　
　　7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入异丙醇，室温放置几分钟。
　　
　　8.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
　　
　　9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心几分钟，弃上清。
　　
　　10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入无RNase的水,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。
　　
　　常见问题分析：
　　
　　1得率低：
　　
　　A.样品裂解或匀浆处理不彻底
　　
　　B.RNA沉淀未完全溶解
　　
　　C.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
　　
　　D．样品匀浆时加的试剂量太少
　　
　　E．匀浆样品时未在室温放置几分钟
　　
　　F．吸取水相时混入了有机相
　　
　　2 RNA降解
　　
　　A.组织取出后没有马上处理或冷冻
　　
　　B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
　　
　　C.细胞在用胰酶处理时过度
　　
　　D.溶液或离心管未经RNase去除处理
　　
　　E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
　　
　　3 DNA污染
　　
　　A.样品匀浆时加的试剂量太少
　　
　　B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
　　
　　预防RNase污染注意事项：
　　
　　1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
　　
　　2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
　　
　　3．RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
　　
　　4．配制溶液应使用无RNase的水
　　
　　本实验已经研磨的各个组织中发现肝脏组织是Z容易研磨，研磨效率是Z好的。
　　
　　下图A是RNA经过传统的液氮研磨和匀浆器研磨法抽出的RNA跑胶图，结果很明显发现这种方法是可行的，是可以代替传统的方法的。

　　
　　下图B是利用组织匀浆器对小鼠的各个组织进行匀浆抽出的RNA跑胶图。发现在抽提各个组织的RNA的时候也是可行的。
　　

　　图C是利用组织匀浆器对人结肠癌标本进行了研磨后抽提出的RNA的跑胶图。
　　

　　图D是小鼠的肝脏组织经过手工研磨和机器匀浆后，抽提得到的RNA进行了浓度的测定，结果说明组织匀浆器抽提出得RNA的浓度要显著高于传统的手工的方法得到的RNA。
　　

　　蛋白质的提取
　　
　　A.根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的蛋白质裂解液（如RIPA），同时加入3颗不锈钢柱。（小鼠肝脏组织加入1mlRIPA蛋白裂解液，人结直肠癌组织加入500ulRIPA蛋白裂解液）
　　
　　B.把加入样品,蛋白裂解液,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子，点击运行。
　　
　　以下同上RNA的操作方法
　　
　　结果所得到的蛋白质浓度的测定经过BCA试剂盒测定完成的，同时通过SDS-PAGE后经过考马斯亮蓝染色和western blot检测都发现其要比传统的方法更加简便快捷，不容易引起交叉污染。
　　
　　更多实验细节可致电工作人员！