RhizoTron根系高光谱成像分析技术

1、概述

根系是植物地下部分为适应陆地生活长期进化而形成的营养器官，具有支撑地上部分的基本作用，不仅在水、矿物质和碳水化合物的吸收、转化和储存中发挥着重要的作用，还能够稳定植物体并与土壤形成物理和化学联系。有研究学者认为，优良根系的品种有利于提高产量稳定性、资源利用效率及对环境胁迫的抵抗力[1]，根系也被作为育种目标。根系的形态，例如根长、根系体积、根系直径和根干物质，可以反映根系的健康情况。当植物受到胁迫时，根系会产生一系列生长和发育、形态、生物量以及生理生化代谢变化以适应胁迫条件。因此，更好地了解植物根系和根际过程有助于提高植物生产和可持续土壤管理的资源效率。

根系研究的关键在于使植物“隐藏的一半”能被可视化和量化。

常用根系表型研究方法及其成像图

传统植物根系的研究方法包括挖掘法、定位法、土钻法等，通过挖根、洗根等操作后对根系进行形态学、生理生化等方面的研究，此类方法不仅破坏性大、耗时长、取样成本高，且存在一定的局限性[2]。近年来，无损成像方法在植物科学中变得越来越流行。传统上局限于RGB成像的高通量应用正在向更宽的光谱范围发展，从而能够对根际成分进行化学成像[3,4]，也为地下根系的研究提供了新的途径。

为了解决传统根系研究方法所存在的缺陷并方便对根系进行成像，市场上出现了一系列产品，如人工培养基（琼脂、发芽纸、水培等）培养植物幼苗的方法，但该方法植株的生长条件受到人们的质疑；微根窗技术是一种非破坏性、定点直接观察和研究植物根系的方法，是活体根系监测、根系动态生长监测Z主要的方法之一。但该方法的缺陷在于窗面及观察深度都比较有限，且在根系生长过程中可能会产生大量细根围绕在玻璃管周围，影响观测的准确性[5-7]。因此，基于根窗技术，填土根箱成像系统应运而生，用于植物根系成像。

基于根箱栽培的植物根系表型RGB成像存在一个缺陷，即需要依赖于根与土壤足够的对比度才能进行自动分割。而高光谱成像数据能够克服根与土壤分割困难的问题，能够对根系表型及生化性状成分进行成像分析。

根系表型研究方法对比

基于此，易科泰生态技术公司结合近几年来国际先进高光谱成像技术创新应用（易科泰 SpectrAPP ® 项目）实验研究，开发了一款RhizoTron®植物根系高光谱成像分析系统，该系统基于根窗技术，可对RhizoBox根盒培养的植物根系进行原位非损伤表型成像分析，具备多功能高光谱成像分析功能，可对植物根系进行高光谱和自发光荧光成像。能够实现植物根系进行原位表型高光谱成像分析和动态监测。可应用于植株根系成像分析、抗性筛选及遗传育种、病虫害胁迫及干旱研究、土壤结构及养分研究等领域。

2、RhizoTron®植物根系高光谱成像分析系统

2.1 系统介绍

RhizoTron®植物根系高光谱成像分析系统可对生长于RhizoBox根盒（带根窗）的作物根系进行高光谱成像分析和UV激发生物荧光成像分析（选配），可选配Thermo-RGB成像分析及冠层表型成像分析。

RhizoTron植物根系高光谱成像分析系统由主机系统和高光谱成像系统组成，其中主机系统包括系统平台（主机箱）、控制单元、样品托、数据处理服务器等组成；光谱成像系统由光谱成像单元（包括成像传感器、光源、云台等）和自动扫描轴组成。

2.2 功能特点

1）基于RhizoTron®根窗技术的高光谱成像分析技术，配有植物培养模块，由样品托盘、适配器、不同规格尺寸RhizoBox根系观测培养根盒组成，或自己制作培养根盒；可选配多通道智能LED培养台

2）标配为60度倾斜自动扫描成像（与植物培养角度一致），同时对RhizoBox根系和幼苗进行高光谱成像分析和RGB成像分析，可选配其它角度如45度、70度和90度（垂直扫描成像）

3）可对根系进行UV-MCF紫外光激发生物荧光高光谱成像，以研究分析根系活动及根系与土壤互作关系、荧光假单胞菌等AvrahamAlonyandRaphaelLinker,2013）；或选配根系Thermo-RGB成像分析

4）可选配顶部冠层RGB成像分析、红外热成像分析、高光谱成像分析、叶绿素荧光成像分析（可选配适于正常培养盆的样品托）

5）可选配iPOT数字化植物培养盆或RhizoBox根系培养盒，持续监测土壤水分温度、重量、植物生长、光合效率、PI（performanceIndex）、茎流等生理生态指标，可自动采集土壤渗漏水并进行土壤营养盐分析

6）模块式结构，具备强大的系统扩展功能，系统平台自动万向脚轮，方便移动

7）可远程控制（选配）、自动运行数据采集存储等功能

2.3 技术指标

1)控制单元为嵌入式操作系统，可进行双重控制（触控屏+PC端全中文GUI软件），实现远程操控相机及平台

2)自动扫描轴推扫速度与精度：1-40mm/s，移动精度1mm，有效扫描范围：标配100cm

3)高光谱成像（标配400-1000nm，可选配900-1700nm）可成像分析植被生理生化指标、健康指数、光合利用效率、植被胁迫、水分、氮素等指数。配备PhenoRoot根系分析软件，如需对地上部分进行同时分析，可选配SpectrAPP分析软件

4）标配RGB彩色成像：分辨率2448×2048像素，配备专业植物根系分析软件

5）SpectrAPP®高光谱成像分析软件：进行光谱融合、ROI选区分析、光谱分析、频率直方图、自动识别不同波段峰值，可分析近百种光谱指数，根据需求定制添加光谱指数，同时能够分析根系表型数据

6）PhenoRoot根系分析软件，可分析根长、根系Z大宽度、凸包面积、根系总长、根系面积（生物量）、根系剖面分析（根系密度）等

7)Thermo-RGB成像融合分析（选配），包括Thermo-RGB融合分析软件，红外热成像分辨率：640×512像素；测量温度范围：-25℃－150℃；光谱范围：7.5－13.5μm

8)多通道智能LED培养台，RGBW四通道智能调整LED光源，0-100%可调，可模拟昼夜节律、不同光配方等，Z大光强300μmol/m2·s

9)叶绿素荧光成像单元（选配），专业高灵敏度叶绿素荧光成像CCD，帧频50fps，分辨率720×560像素，像素大小8.6×8.3µm，可自动运行Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭分析、光响应曲线等protocols，自动测量分析50多个叶绿素荧光参数，包括：Fv/Fm、Fv’/Fm’、Y(II)、NPQ、qN、qP、Rfd、ETR等，自动形成叶绿素荧光参数图

10)系统平台规格：标配约145cm×60cm×160cm（长×宽×高）、重量约50kg

左图为顶部冠层高光谱成像（NDVI），右图为根系成像提取（EcoTech®实验室提供）

3、应用案例

3.1 甜菜根系RGB及高光谱成像分析：

以甜菜为实验对象进行了实验，对其根系进行RGB成像和高光谱成像（900-1700nm），分别进行了形态分析和生化性状进行分析[8]。

1）形态分析：以手动分割作为参考，使用RGB和高光谱图像跟踪甜菜根系的生长、形态和结构，发现基于RGB自动分割并不能很好的区分老根和土壤，跟踪根系总根长误差为6.94%；高光谱成像通过光谱比率获得根系的二值图像进而对根系长度进行分析，误差仅为1.5%。使用紫外灯（UV）与模拟太阳光照射得到的根系可视化图像，发现在明亮背景下UV图像更易识别根系。

左：RGB原始图像；中：(A)使用绘图板手动分割根系，(B)顶部分割不良的旧根轴区域，(C)图像底部正确分割的新根轴，(D)基于RGB获得的二值图像；右：基于高光谱获得的二值图像

UV和模拟太阳光根系可视化图像。(A): UV；(B): 模拟太阳光

2）生化性状分析：对不同发生位置及成熟度的根系和土壤的平均光谱进行分析，发现三种根系光谱曲线存在显著差异，且1100nm附近新侧根与主根出现吸收峰，而老根并未出现。但老根与土壤反射曲线趋势较一致，在水分吸收区域（1450nm）附近，根系光谱斜率高于土壤。同时，它使用不同含水量土壤校准根盒的平均光谱进行校准，从而绘制根箱上水分分布图。

左：三个根ROI(老根和新侧根、主根)和两个土壤ROI(根箱的顶部和底部)的平均光谱；右：根箱上的水分分布图。

3.2小麦根系RGB及高光谱成像分析

以小麦为实验对象，对植株进行扦插处理，扦插后14、28、47、94、101和201天对根箱的上三分之一进行高光谱成像（900-1700nm)和RGB成像，分别进行了形态分析和生化性状进行分析[9]。

1）形态分析：使用WinRhizo对根长度进行结构量化，以手动分割作为参考，分别使用高光谱图像和RGB图像对根系可见根长度进行预测，结果表示，基于RGB分割为83.4%，光谱分割为77.0%。但两种分割方法的斜率没有显著差异（P=0.225）。表明两种方法在预测此处使用的基质的可见根长度方面具有相似的性能。

通过自动光谱和颜色分割方法预测人工跟踪的可见根长度

2）生化性状分析：基于光谱特征，使用决策树模型对根像素的径级类别进行预测，其训练集为r=0.86，验证集r=048；基于一阶导数差分光谱（1649-1447nm）构建根系腐烂时间指数模型，使用修剪后28天和101天的光谱数据作为验证集，其r2=0.96。

左：根光谱反射率的径向模型，使用从中心到边界以0.2 mm增量的八个径向类的训练决策树模型并进行分类。整个根图像上的白色帧表示顶部和底部特写部分的位置；右：光谱反射率(一阶导数差谱1649~1447nm)与衰减时间(拍摄后天数)的关系

3.3 土壤含水量估测及根腐病识别

以甜菜为实验对象对其根系进行高光谱成像（900-1700nm)，同时测定与实验相同土壤的根箱中的不同土壤含水量及高光谱成像，以此作为训练集对含水量模型进行训练，对根箱的每个土壤像素的含水量进行预测；以油用萝卜作为实验对象，使用化学计量分析对根系不同时间后腐烂的光谱特征进行识别，通过光谱的时间变化推断根系腐烂情况[10]。

左：根箱土壤含水量预测；右：油用萝卜覆盖作物高光谱图像根系分解分析。(A)上图:三个时间点的原始光谱和一阶导数。下图:基于1040和1450 nm一阶导数差分光谱的衰减函数。(B)所示光谱的三次示例图像。

3.4不同基因型扁豆霉菌根腐病的RGB和高光谱成像评估

以不同基因型扁豆为实验对象，分别进行RGB成像和高光谱成像（550-1700nm），研究高通量表型技术评估霉菌根腐病的严重程度，以快速鉴别耐药基因型。设置对照组和实验组，培养14日后实验组接种黄芽孢杆菌，对照组施以清水。接种14日后使用0-5疾病评分量表对根系进行评分，作为地面参考数据[11]。

霉菌根腐病严重程度量图

RGB图像：通过提取特征变量对植物生物量研究，发现投影面积与植物生物量有很强的相关性，与地下生物量相关性高达0.9，地上生物量相关性为0.84；对根系病害程度进行预测，发现其R2达到0.67，而通过地上部特征变量进行预测，其R2仅达到0.23。

GH_LSP和GH_RIL小扁豆面板RGB图像投影面积与植物根、茎干重的相关性

高光谱图像：通过提取感兴趣区的光谱，发现从地上样品的高光谱反射曲线来看，健康和感染的样品光谱反射曲线相差较小，而根系的光谱曲线差异较显著。使用归一化差异光谱指数（NDSI）对根系疾病程度进行预测，其R2达到0.54，使用地上部光谱特征进行预测，其R2仅为0.27。

小扁豆的平均反射光谱(GH_LSP和GH_RIL数据)。(A)GH_LSP基因型小扁豆新梢的平均光谱曲线。(B)GH_RIL基因型小扁豆新梢的平均光谱曲线。(C)GH_LSP基因型小扁豆根系的平均光谱曲线。(D)GH_RIL基因型小扁豆根系的平均光谱曲线。

小扁豆叶、根图像RGB和高光谱特征的预测性能。

3.5 油菜重金属铅(Pb)含量的高光谱估测

以油菜为实验对象，对叶片和根系分别进行高光谱成像，对根系图像进行比值运算（根部：861.96/480.46nm），油菜叶片和根的分割阈值t分别为1.3和1.6，使根系与背景进行图像分割。分别建立支持向量机（SVM）和SAE深度神经网络对样品中的铅（Pb）含量建立模型并预测，发现SAE深度神经网络模型精度较高。在SAE模型的基础上使用迁移学习的方法得到T-SAE模型，并对油菜叶片和根系中的Pb含量进行预测，发现其精度有所提升，油菜叶片达到0.92，根系达0.93。基于此可以发现高光谱成像技术结合深度神经网络能够对油菜植物中的重金属Pb进行定性定量检测[12]。

不同铅浓度胁迫下油菜样品的高光谱曲线。注:(A)和(B)分别代表油菜叶片和根系的ROI高光谱信息。此外，(C)和(D)分别代表了不同铅胁迫下油菜叶片和根系ROI的平均高光谱信息。

铅含量预测的Z佳T-SAE模型。注:(A)和(B)分别代表了用T-SAE模型预测油菜叶片和根系铅含量的Z佳结果。

3.6 野生植物幼苗根系高光谱成像分析

易科泰EcoTech®实验室技术人员以一株野生型元宝槭幼株为样本，采集900-1700nm高光谱数据，并对其进行光谱成像分析及根系形态分析。

左：样本RGB照片；中：归一化氮素指数（NDNI）；右：比值指数R1100/R1450

植株不同部位的 900-1700nm 反射光谱

基于SpectrAPP软件的根系分析结果。左图为R1100/R1450，显示了根系不同部位的水分分布状态，右图为根系形态分析结果

4、参考文献

[1] Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main (1960).；Kenrick, P., & Strullu-Derrien, C. Theorigin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).

[2] 秦天元, 孙超, 毕真真等. 植物根系成像技术研究进展及马铃薯根系研究应用前景[J]. 核农学报, 2019, 33(02): 412-419.

[3] Dhondt S, Wuyts N, Inzé D. Cell to whole-plant phenotyping: the best is yet to come. TrendsPlant Sci. 2013; 18:428–39.

[4] Pierret A. Multi-spectral imaging of rhizobox systems: new perspectivesfor the observation and discrimination of rhizosphere components. Plant Soil. 2008; 310: 263–8.

[5] Vamerali T, Ganis A, Bona S, Mosca G． An approach to minirhizotron root image analysis［J］． Plant and Soil, 1999, 217( 1/2) : 183－193.

[6] Johnson M G, Tingey D T, Phillips D L, Storm M J. Advancing fine rootresearch with minirhizotrons [J].Environmental and Experimental Botany, 2001, 45( 3) : 263－289.

[7] 秦天元, 孙超, 毕真真等. 植物根系成像技术研究进展及马铃薯根系研究应用前景[J]. 核农学报, 2019, 33(02):412-419.

[8] Gernot B , Mouhannad A , Alireza N , et al. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setupand Imaging Protocols. [J]. Journal of visualized experiments : JoVE, 2017, (126).

[9] Gernot B, Alireza N, Thomas A, et al. Hyperspectral imaging: a novel approach for plant root phenotyping.[J]. Plantmethods, 2018, 14(1).

[10] Gernot B , Mouhannad A , Alireza N . Root System Phenotying ofSoil-Grown Plants via RGB and Hyperspectral Imaging. [J].Methods in molecularbiology (Clifton, N.J.), 2021, 2264245-268.

[11] Advanced Imaging for Quantitative Evaluation of Aphanomyces RootRot Resistance in Lentil[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10.

[12] Nakaji T, Noguchi K, Oguma H. Classification of rhizosphere components using visible–near infrared spectral images. Plant Soil. 2008; 310: 245–61.