耳石截面的制备

引言

耳石（脊椎动物内耳）的显微组织分析对于研究鱼的生长模式和年龄是一个重要的工具。这一信息可进一步用于总的鱼群、物种动态特性、以及了解环境变化的影响等更大范围的研究。 

鱼的年龄通常是通过检查和计数鳞片上的生长环或是在耳石（内耳的小骨）上看到的环状组织来确定的。这些环对应于环境的季节变化并可以与树干的年轮相比较。如果这些环生长迅速，它们的间隔就比较宽；当环与环之间的间隔比较窄时，就表明生长比较缓慢。

耳石共有三对，Z常分别称为耳沙（内耳囊状物部分的一种石状物）、扁平石（多数鱼的两个耳石中较大的一个）、和星状耳石。它们的所在位置、功能、尺寸、形状、以及超微结构方面均不相同。这些差异会影响到制备方案的确定，例如抛光面以及所必需的制备量。

尺寸具有特殊的重要性，因为较大耳石具一般有较大的三维深度和不规则性，从而限制了显微组织的外观观察。另一方面，对于较小的耳石，有可能不经切割或抛光就可以观察其显微组织。

大多数情况下，需将耳石清洁而准确地切割成非常薄的截面。这样就可以看到环状组织。对于厚度大于100μm的耳石，将试样抛光可能会更好些。这样做在观察环状组织时将使分辨率得到改善。

为了能继续增进对鱼群动态特性的了解，很好地确定耳石的分离、制备、和分析技术并适当侧重质量控制十分重要。许多情况下，研究者已经拟订出针对某一物种的特定方法。这里所介绍的方法还是属于相当一般性的。

制备步骤

1.记录鱼标本的数据。然后将耳石与鱼分离。在漂白剂中适当地清洗并用蒸馏水冲洗。用酒精溶液去除任何残留的水分，然后对所选的耳石进行称重和测量。

2.对试样选择适当的镶嵌介质。对于经过横向切割后仍保持完整的试样，通常选用石蜡作为镶嵌介质。如果截面还将进行抛光，建议采用具有低粘度的硬介质，例如EpoHeat™加热固化环氧树脂。

3. 准备一个模具并涂敷脱模剂以便使试样容易脱模。根据制造商的指示将镶嵌介质进行混合。浇入模具至一半高度，然后等候环氧树脂固化。

4. 将耳石放入半填满的模具中。用一滴氰基丙烯酸脂胶在一定取向位置将耳石粘附于已固化的环氧树脂。这样做可以在剩余的环氧树脂浇入模具时，试样不会移位。

5. ZH将镶嵌介质浇入模具，使其完全覆盖耳石。然后等候环氧树脂固化。

6. 用 IsoMet^® 型精密切割机并使用15LC 型切割片将耳石周围多余的镶嵌介质切除。由于能减少在磨光过程中需要除去的环氧树脂表面面积，因此能省去制备时间。平行切一刀将能保证建立正确的抛光面。切割片的选择能影响ZZ结果的质量。以钙为基础的耳石相当软，用常规的砂轮片就可以进行切割。然而，金刚石切割片的刚性却可提供更多的控制，一般能产生更直的切割。

7. 用Crystalbond镶嵌石蜡将镶嵌好的耳石粘附在玻璃载片上。您需要将热板预热到胶的软化温度以上(85-100 °C)。调整好镶嵌试样在玻璃载片上的取向，使需要Z初进行抛光的表面朝上并平行于感兴趣的平面。

8. 用一系列CarbiMet^® 型碳化硅砂纸进行磨光，从240粒度(P280)直到1200粒度(P2500)。握住载片使其平行于磨光表面，对表面施以均匀的压力。当磨光进入耳石后，要经常用光学显微镜检查截面。要检查芯部的出现和位置。ZX部位是一个圆形区域，其周围有一些反差相对较高的同心环，其直径约小于20μm。当您接近芯部时，换用粒度较细的砂纸。

9. 一旦达到ZX部位，用MicroPolish^® 系列粒度为0.3微米不会团聚的氧化铝磨料将试样表面在MicroCloth^® 型抛光织物上进行抛光。

10. 清洗并观察耳石的表面。单面制备有可能使环状组织有足够的分辨率。然而，对于较大的耳石，需将双面进行抛光才能获得更高的分辨率。

11. 将玻璃载片再次放在热板上，使Crystalbond石蜡正好能够软化。将玻璃载片从抛光好的耳石镶嵌试样移开。在玻璃载片上再添加一些石蜡，并将一小片玻璃放在石蜡上。在这片玻璃上再添加一些石蜡以固定住镶嵌试样。增添一片玻璃是为了增加制备过程的工作距离。这样做可以使得在玻璃载片之上更容易握住试样，因为试样截面已经变得更薄了。另一个变通办法就是在MiniMet^® 1000型磨光-抛光机上使用一个薄截面夹持器（商品编号69-1583）。将制备过程自动化可以接省时间。用手进行磨光还可以集中磨薄截面的某一面或另一面，ZZ使某一面更薄一些。

12. 将玻璃载片从热板拿开并将抛光表面放在玻璃片上。施加压力，避免在镶嵌试样和玻璃片之间形成气泡。

13. 和以前一样进行抛光，密切监控进程直到截面厚度达到10至50μm。目测观察芯部及增长环是否具有足够的反差。用MicroPolish^® II 型抛光悬浮液在MicroCloth^® 型抛光织物上进行ZZ抛光。

注：耳石的形貌与鱼的物种和年龄有关。在有些情况下，可能会出现更复杂的形貌。例如，耳石的生长轴会处于几个相交的平面上。其后果是，单独一个平面不能包含芯部和所有的增长环。为了得到完整的纪录，需要交替进行抛光并将显微组织进行拍摄。然后进行叠化以观察到完整的显微组织。尽管观察的复杂性以及多个观察面，制备过程本身基本相同。

设备*

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IsoMet^®系列线性精密切割机

MiniMet^® 1000型磨光-抛光机

消耗器材*

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IsoMet^®金刚石薄切割片

EpoHeat™

脱模剂

Crystalbond镶嵌石蜡

CarbiMet^®碳化硅砂纸

MicroPolish^® II型、粒度为0.3μm不会团聚的氧化铝悬浮液

MicroCloth^® 型抛光织物