NanoLC-蛋白质组学研究质谱分析的**前端分离工具

美国戴安公司的LC-PACKING纳升级HPLC是当今世界Zxian 进的微量色谱之一.已经广泛应用于蛋白质组学的研究 领域.特别是其同MADLI TOF质谱的完全兼容性,使得LC- PACKING更是广大MADLI TOF质谱用户的**选择. LC Packings/Dionex /Nano LC 系统的组成: 1.UltiMate™微孔泵和检测单元 流速范围从 50 nl/mi n 到 200 µl/min,压力范围0-6000psi 2.FAMOS™ 微量自动进样器，样品体积：50nL-5 µl， 5 µl-1mL，注入样品量为 1 µl 输出样品量也是1µl (无样品丢失)，取样对象可以是96384多孔板，1.5ml 样品瓶（密封与开口均可，（双针技术）放置7块384孔 板，可连续取样2688次内置双泵可以完成梯度2D色谱 分析. 3.Swithchos™ 微孔柱切换单元，允许全柱切换和快速 加载样品典型的装置 4.Probot 微量样品收集器,是目前**一种可以直接将 分离样品点在MALDI TOF 质谱专用板上的样品收集仪 器.可以同ABI公司,布鲁克公司等大型TOF质谱直接连 接. 工作流程 用 FAMOS™向反向捕获柱注入样品, 使用Switchos™加 载泵以 30 µl/min的速度加载样品. 样品进到捕获柱后， Switchos 阀切换关闭， UltiMat e™ 单元的Nano梯度以 200 nl/min的速度将捕获柱中 的浓缩样品反冲到NanoLC的分析柱中，分析柱直径是7 5 µm ，填料是C18 PepMap™.，各种组分在这里分离然 后进入质谱检测NanoLC的技术特点 1.提供了比 毛细管液相更高的灵敏度2.使用 Capillar y/Nano 柱，可在日常工作中达到Z高的分离效率和极 好的峰容量 3.由于分析柱极小的直径，成为分析极少的样品量和稀 释样品的极好分析技术4.确保Z少的样品丢失与质谱联 机有zhuo越的性能（特别是具有电喷雾离子源（ESI）的 在线质谱，可以Z小的流速提供高浓度的样品） Capillary/Nano LC 与 MS联机: 1.可达到Z高的灵敏度，使得毛细管/毫微级液相** 的分离效果与质谱Z高的分辨检测结果有机地结合； 2所有的进样分离检测和数据处理全部自动化： 全自动样品处理和导入多维分离MS/MS测序和采 集数据库搜索；3翻译后的修饰的鉴别；4可大大 增加蛋白鉴别的通量5可与ESIMALDI离子源质谱 联机 Peak parking 峰停驻技术 峰停驻技术用来增强 MS/MS 的灵敏度,用来分析不太复 杂的蛋白混合物(<50)；峰停驻技术可配合使用原位消 化技术，使灵敏度增加（样品量减少，光谱信息增 加）； 可改进数据质量和序列的覆盖面 原位消化技术 与2D胶相比可增加蛋白识别数量；可识别高含量蛋白污 染下存在的低丰量蛋白，同时极大地节省实验时间 峰停驻技术可做下列描述： •进入质谱的峰淋洗速度被降低，使得有更多的时间识 别先进入的离子. •同时从 Nano LC分析柱来的淋洗液被停止. UltiMate™ 系统 提供Nano梯度淋洗(200 nl/min), 在 Nano LC (75 µm i.d.)柱中进行分离，被分离的组 分通过微量阀进入质谱，一旦进入质谱的峰达到一个确 定的峰高，MS将切换成MS/MS方式并得到MS/MS的光 谱 ，同时给出两个信号 ：1微量阀被通知关闭，喷 射泵与MS在线连接，喷射泵以 25 nl/min的速度工作， 给质谱留有更多的时间得到MS/MS光谱,. 2UltiMate ™ 系统被通知保持梯度 (35%B remains 35%B) ，流 速进一步降低以保持柱压的稳定，一旦质谱中的峰从一 个确定的溢出或确定的高度开始下降，MS开始切换回质 谱的模式，微量阀和UltiMate™接到通知恢复到峰停驻 发生开始时的条件 NanoLC 2维液相色谱技术 2维毛细管/NanoLC/MS可取代2D凝胶分析2D凝胶被广 泛地应用在蛋白质组学的研究中，但它有下列的缺点： 1重现形不好 2覆盖的蛋白数量少 3对低峰量蛋白的灵敏度不够 4消耗时间和劳动力 5pH范围有限 6不能直接与质谱在线联机 以下是典型的UltiMate Nano LC系统2D分离的流程： 样品用FAMOS微量自动进样器注入到BioX-SCX离子交换 捕获柱上.通过自动进样器上的梯度泵缓慢梯度改变淋 洗盐溶液浓度(at 30 ul/min),从 BioX-SCX柱上将肽的 不同片段分别洗脱,并通过RP捕获柱分别收集，当捕集 到肽后，盐被冲洗出系统并确认盐不会进入MS,此时Nan oLC的主梯度泵(200 nl/min) 开始从捕获柱反冲肽 片段进入NanoLC毛细管分析柱，肽在这里被分离,Z后 进入MS做定性