见微知著 | 一次性实现组织微区中5000多个蛋白的空间分布研究

在前期的案例中，液质联用技术联合激光显微切割（Laser Microdissection, LMD)技术，成功实现了空间深度代谢组学和脂质组学的分析^1，2。随着蛋白质组学质谱技术的发展，最新的空间蛋白质组学可以在细胞和组织水平上的实现蛋白空间分布和相互作用研究，得到蛋白在细胞特异性表达等重要信息³。通过LMD技术将感兴趣的组织微区或细胞样品进行精确切割和收集，经过微量样品蛋白提取并酶解成肽段，进而使用高灵敏度质谱进行检测，以获得不同空间位置和功能区域的蛋白表达图谱。空间蛋白质组学研究有助于分析疾病早期演化及特定病理环境下的空间-分子基础，可以为疾病的致病机理研究和早期诊断治疗提供重要线索。

与传统的蛋白质学前处理不同，基于LMD技术得到的样品体积小，蛋白含量低，需要高灵敏度的检测技术从而挖掘更加丰富的蛋白质信息。

在本次实验中，从小鼠心脏切片上，LMD实现了约0.2mm²大小的组织微区样品的快速切割和收集。LMD具备下述技术优势：

第一、切割精准，真正实现“所见即所得”；

第二、灵活度高，切割目标区域按需随意选取，激光能量可调以适用不同组织类型，同类样本的可累积收集达到需要样品量等；

第三、操作简便快捷，LMD能够在数秒中的时间内完成图1所示样品的高效地切割和收集，保证结果真实性。

ZenoTOF 7600系统具有Zeno trap功能和全新的Zeno? SWATH DIA工作模式，可以有效提高肽段检测灵敏度; 同时超快的采集速度（窗口数为85个）实现肽段二级的高效覆盖。优异的灵敏度和超快的采集速度，保证微量样品中蛋白组的深度分析。本次实验中从约0.2mm²大小的小鼠心脏组织样品提取的蛋白，经过ZenoTOF 7600的采集分析，每次都可以鉴定到超过5300多个蛋白。结果证明ZenoTOF 7600具备优异的灵敏度和采集速度，适用于LMD切割收集的微量样本中蛋白组的深度分析。

SWATH是开创的非标记定量蛋白组学的黄金技术，被广泛应用于大队列蛋白组样品分析。Zeno? SWATH DIA是在 ZenoTOF 7600系统上开发的全新一代的非标记蛋白组分析技术，具备样本通量高、蛋白覆盖深、定量高精准等优势。本次实验的结果显示，Zeno? SWATH DIA技术检测到的可定量蛋白（CV<20%）占总鉴定蛋白数量的比例超过92.5%，表明微量样本的蛋白组分析的优异重现性和结果的高可信度，满足LMD采集的组织微区中蛋白表达谱的检测要求。

小鼠心脏组织切片（10μm）经过激光显微切割(LMD)并收集约0.2mm²大小的区域（图1）；经过一些列的样品前处理，从收集到的微区样品中提取总蛋白并酶切成肽段；最终，样品经过 ZenoTOF^? 7600采集分析其中的蛋白组信息。

使用NanoLC系统， 流速为350 nL/min, 60 min整体洗脱梯度。 ZenoTOF 7600系统采用Zeno? SWATH DIA采集方式，一级扫描范围400-1500，可变窗口数：85个，二级扫描范围100-1500 。

Zeno? SWATH DIA数据使用DIA-NN1.8.1软件处理，使用library-free模式，数据库采用UniProt下载mouse的fasta蛋白序列。

样品用Zeno? SWATH DIA方法重复采集三针，从TIC图上看（图3），在纳升液相系统下，肽段在60min梯度内得到很好的分离，并且有很好的重复性和信号强度，表明仪器在数据采集过程中有很好的稳定性，从而保证实验结果的准确可靠。

图3. Zeno? SWATH DIA采集样品的总离子流图（TIC）

统计样品三针重复的结果，以小于1% Global FDR为标准，三针重复共计鉴定到5394个蛋白（图4A），三针共有的蛋白鉴定数为5207。以三针重复定量结果CV<20%为标准，可定量蛋白数目有4991个，即超过92.5%的蛋白都能被准确地定量。从肽段precursors水平上来看，三针重复共计鉴定到48669个肽段（图4B），CV<20%的数目为41521。Zeno? SWATH DIA的结果都具有很好的重复性和定量准确性，充分体现了这一技术面对LMD处理的微量样品的优势。

将原始数据导入skyline软件进行分析，无论对于信号高的肽段（如蛋白D3Z6P0的特征肽段TAEGIAEWLR，图5A）,还是信号比较低的肽段（如蛋白E9PV24的特征肽段GLIDEANQDFTNR，图5B），都可以提取到很好的XIC图。表明ZenoTOF 7600系统的Zeno trap通过二级碎片离子进行富集，特别是对于低丰度肽段二级的富集，实现检测的高灵敏度和高重现性，保证结果的真实和可靠性。