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SPRI (Solid Phase Reversible Immonilization) 固相可逆固定化是磁珠法核酸纯化的基础。依托这一技术,AMPure XP磁珠纯化方法在NGS、核酸检测、合成生物学等领域大放异彩。不只是AMPure XP,贝克曼库尔特RNAClean XP,针对转录、逆转录、RNA和cDNA合成等体外应用,可提供RNA和 cDNA纯化方案。其利用优化的缓冲液选择性地将RNA或cDNA与磁珠结合。过量的寡核苷酸,核苷酸,盐和酶可以通过简单的洗涤程序去除。RNAcleanXP卓 越的核酸回收率和纯度,可直接用于下游多项应用,已被超20种 RNA-seq 建库试剂盒建议使用,超过 1000篇文献引用。
RNAClean XP工作流
采用 RNAClean XP 纯化三个不同起始浓度的样品,0.5 ng/μL,1 ng/μL,5 ng/μL。纯化平均回收率达到75%以上。
RNAclean XP特点
认证的无核糖核酸酶(RNase)
去除盐、过量的引物和 dNTP
不使用有机溶剂、真空过滤或离心步骤
兼容手动和自动化,自动化操作友好,无离心、过滤或沉淀步骤
应用案例
应用1.
In Vitro Transcription体外转录RNA产物纯化
CRISPR sgRNA/ crRNA制备
Peter S. Solomon等1将线性化的sgRNA质粒作为模板进行体外转录。HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)试剂盒37度18hr反应合成sgRNA。随后采用RNAClean XP磁珠纯化sgRNA产物,Qubit定量后− 20 °C保存。类似的,Pardis C. Sabeti等2同样采用RNAClean XP纯化以annealed T7 promoter oligo及DNA模板合成的crRNA产物。
Figure. Two-part gRNA和single gRNA结构. (From IDT官网)
5‘RACE IVT产物纯化
Sascha Sauer等3采用cDNA 5′末端快速扩增与深度测序(5′ RACE-Seq)评估超出+3核苷酸的序列对T7启动子活性的影响。实验发现+4和+8核苷酸之间的序列motif对转录输出影响达五倍。而这些motifs可以作为IVT反应优化的指南。其中,RNAclean XP在5′ RACE-Seq和IVT 验证实验中,帮助完成T7 RNA合成产物的纯化回收。
Figure. 5′RACE-Seq研究T7启动子受序列影响实验流程
应用2.
rRNA及DNA depletion产物纯化
许多N6-甲基腺苷(m6A)mapping方法需要大量的RNA或仅限于培养的细胞。Dahl等4开发了皮克级m6A RNA免疫沉淀和测序(picoMeRIP-seq)方法,用于单细胞和稀有细胞类型的in vivo m6A研究。在实验第 一步rRNA和DNA去除环节, NEBNext® rRNA Depletion Kit的工具酶处理后,研究人员采用RNAclean XP进行post-RNA纯化回收。值得注意的是,RNAclean XP也是 NEBNext® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) 试剂盒中标明需使用的磁珠纯化试剂。
单细胞MeRIP–seq方法及分析pipeline
应用3.
Nanopore tRNA-Seq 文库制备
tRNA是翻译中重要元件之一。Novoa等5开发了Nano-tRNAseq。这是一种基于纳米孔的native tRNA群体测序方法,可在单个实验中提供tRNA丰度和动态修饰的定量评估。通过对纳米孔raw电流强度信号的重新处理,回收tRNA reads增加12倍,支持准确的tRNA丰度评估。Nano-tRNAseq实验过程中,研究人员则是采用贝克曼RNAclean XP磁珠完成5′ and 3′ splint adapter连接产物,逆转录后线性tRNA产物,以及ONT RMX sequencing adapter连接产物的纯化回收。
应用4.
单细胞RNA纯化
分析single B cell的B细胞受体(BCR)对了解体液免疫反应至关重要。Viant等6-7描述了一种测序,克隆和表征编码BCR抗体基因的方案。作者采用该方法分析了不同小鼠B细胞群BCR的体细胞超突变,克隆和系统发育关系以及它们对同源抗原的亲和力。实验中,采用贝克曼RNAclean XP磁珠完成流式分选单细胞的RNA纯化回收。随后将RNAclean XP洗脱获得的痕量RNA用于逆转录和重链轻链基因PCR放大。
Figure. 分离B细胞和产生单克隆抗体的方案流程
自动化加速你的
RNAclean XP实验
基于SPRI技术的RNAclean XP磁珠不需要离心或真空抽滤,自动化友好。支持适配贝克曼Biomek i-series自动化工作站,完成工作流中的RNA或cDNA纯化实验。自动化方法一旦编写、优化成型,每一次运行都会按照既定步骤一一完成,标准化你的实验流程,减少人为错误,提高实验重现性。Biomek i-series自动化系统可配置96通道加样器,同时处理RNAclean XP样品的数目可轻松突破96个样品,甚至384个样本。
RNAClean XP自动化工作流及时间预估
RNAClean XP自动化方法预览
Biomek method launcher可将方法归类,提示实验所需每种试剂、耗材的摆放指引。方法选项选择器 MOS则可提供特定于样品通量、液体体积、时间、洗涤次数等过程选项和工作流定制的灵活性。帮助你自动化高通量的纯化实验,加速研究进程。
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