细胞外囊泡在肺癌PD-L1免疫治疗生物标志物上的应用

肺癌位居全球癌症死亡数榜首和新增数第二位，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%。对于缺乏驱动突变（如EGFR、 ALK）的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者，免疫检查点抑制剂（ICI），如针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的抗体，已经彻底改变了肺癌治疗的方式。

四种上市的 PD-L1 IHC 检测方法，分别为 pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab 和 durvalumab共同开发，并已被批准作为相应药物的伴随或补充诊断³。

细胞外囊泡（EVs）或许就是解决这类难题的生物标志物来源。这些小的膜颗粒由所有活细胞释放，并通过携带特定的蛋白质、脂质和核酸（例如，DNA、RNA），从分泌细胞传递到周围细胞，从而介导细胞间通信。肿瘤细胞同样会向外周血液中排放数量众多的EVs，将EVs作为新型癌症生物标志物在临床常规检测中具有广阔的前景⁴。

近日，来自德国的研究人员在J Extracell Vesicles杂志上发表文章，报道了肿瘤相关的细胞外囊泡（EVs）用于预测tPD-L1低或缺失的患者对免疫疗法的反应⁵。

目前认为有两种不同的EV群体：直径在50-150 nm之间的小EVs（sEVs，以前被称为“外泌体”）和直径在100-1000 nm之间的大EVs（lEVs，以前被称为“微囊泡”）。由于lEVs体积较大，更易用于常见的诊断工具（如流式细胞术）进行分离和分析。该研究正是试图选择lEVs作为研究对象。

肿瘤抗原在lEV上高度表达。9种肿瘤抗原在5种NSCLC细胞系的细胞裂解物、lev或sev中的表达情况（仅展示H596一种细胞系结果）。actitin‐4作为lEV标记物。

作者首先分离并表征了五种不同分子亚型 NSCLC 细胞系中肿瘤相关抗原在 lEV 和 sEV 上表达的差异。结果表明lEV上存在的全部肿瘤相关抗原，其中一些甚至比sEV的水平要高得多。确定了lEV作为后续研究的可能性。

从 NSCLC 患者血浆中分离的 lEV 和 sEV 的 电镜照片（左）和NTA对比（右）结果，健康对照（CTLh）、非癌症对照（CTLnc）和非小细胞肺癌患者。

作者接着从NSCLC患者血浆中分离出sEV和lEV，排除血浆脂蛋白对lEV的严重污染可能性后。通过NTA、western blot，发现NSCLC 患者外周血中lEV的浓度和大小与对照组相比没有变化。

NSCLC 患者血液中肿瘤抗原负载的 lEV升高情况。（A）流式细胞术显示PD-L1和EMMPRIN肿瘤抗原阳性的 lEV数量变化Z显著。（B） 从 NSCLC 患者和健康对照中分离的 lEV 中 EMMPRIN 和 PD-L1 表达的蛋白质印迹结果。（C）ROC 曲线用于确定单独升高的肿瘤抗原lEV或所有六种联合抗原的鉴别能力。

进一步的流式细胞术的结果表明NSCLC患者血液中PD-L1和EMMPRIN 阳性lEV的水平显著增加，且两者呈正相关。而MUC1、ROR1、ROR2、EGFR阳性lEV与正常组也有差异性。免疫印迹的结果进一步证实了这种富集。通过ROC分析表明，EMMPRIN单独预测Z佳，AUC为0.75（95%CI：0.66‐0.84）。而所有六个标志物的组合预测则更准确， AUC为0.80（95%CI：0.69-0.90）。该结果表明lEV相关肿瘤抗原具有作为NSCLC患者诊断生物标志物的潜力。

（a）根据血液中肿瘤抗原阳性PD-L1 lEVs的数量，绘制了NSCLC患者的Kaplan–Meier生存曲线。(b)初次诊断时未治疗的NSCL患者与 3 个月（R/NR3）或 6 个月（R/NR6）CT分期时血液中 PD-L1阳性 lEV 水平对比，如果患者表现出完全或部分缓解或疾病稳定，则将其分层为应答者 （R），如果患者表现出疾病进展的迹象，则将其分层为无应答者 （NR）。左图包括所有接受治疗的患者，右图为治疗方案中包含免疫治疗的患者。

接下来，作者研究了NSCLC患者血浆中PD-L1、EMMPRIN、EGFR、MUC1、ROR1和ROR2 lEVs的增加是否会影响患者的生存率。结果发现血液中只有PD-L1 lEVs含量高的NSCLC患者甚至表现出明显更好的OS。同时，在进行相应的化学免疫治疗（CIT，n = 37）， 单免疫治疗（Mono-ICI，n = 14）或靶向治疗（TT，n = 9）之后，与未应答组相比，应答者的PD-L1 lEVs水平明显更高，而其他抗原相关lEVs未见显著变化。

（e） NSCLC患者根据其组织PD-L1（tPD-L1）表达进行分组。在治疗 3 或 6 个月后S次分期 CT 中被归类为 R 或 NR 的患者中，比较单独化疗 （CIT） 或联合单免疫疗法 （ICI） 前 PD-L1 lEV 的水平。（g）ROC 分析比较PD-L1 lEV按 tPD-L1 水平分组患者中的预测能力。

tPD‐L1在常规临床诊断中被用作预测免疫治疗反应的标准。然而，tPD‐L1水平低或缺失(分别<49%或<1%)的晚期NSCLC患者也可以从免疫治疗中获益。而tPD-L1水平和肿瘤比例评分（TPS）均未与同一患者PD-L1 lEV的水平具有相关性。而在根据患者的 tPD-L1 水平对患者进行分组后，在tPD-L1表达缺失组（＜1%）和tPD-L1低表达的患者（1-49%）中，检测到应答者的PD-L1 lEV水平明显高于非应答者，相比之下，高tPD-L1（>49%）的患者则没有这种差异。ROC的结果也表明PD-L1 lEV对于治疗效果的预测能力在 PD-L1 缺失组 （AUC 0.91;p = 0.01）和低组（AUC 0.90;p = 0.09）极其优异，而对 tPD-L1-高患者的预测能力相当低 （AUC 0.57;p = 0.64）。

总之，该研究结果将血浆 lEV 上的 PD-L1 确定为一种新的生物标志物，可以预测 tPD-L1 表达低或缺失的 NSCLC 患者对免疫治疗的反应。

在37°C和5% CO₂的条件下，用补充了10%热灭活（56°C，30分钟）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基培养人源NSCLC细胞系（ATCC，DSMZ）。为分离EVs，排除支原体污染的细胞（6xT175培养瓶，贴壁率60-80%）用PBS洗涤两次，然后在RPMI-1640中培养24小时，该RPMI-1640补充了10%的EV-去除 FCS（在4°C下离心16小时，153,700 g，并通过0.2μm滤器过滤，以去除胎牛血清所含EV）。收集上清液在500 g离心5分钟，然后1,500 g离心15分钟以去除残留的细胞和碎片。然后在17,000 g离心30分钟收集lEVs沉淀，上清液继续在143,000 g离心90分钟以收集sEVs沉淀。用PBS洗涤EVs一次并用于下游分析。使用差速超速离心法从Z多15毫升的EDTA抗凝血进行EV分离。所有EV颗粒在PBS中洗涤一次并储存在PBS中以进行后续实验⁷。