文献解读 | 蛋白质组学样本制备-植物篇
2024-09-07120研究背景
植物蛋白质组学分析面临的主要挑战包括蛋白质浓度低、次生代谢产物含量高以及细胞壁难以破坏等。传统的蛋白质提取方法往往需要使用表面活性剂和变性剂，这可能会抑制蛋白酶活性并降低质谱信号。因此，在LC-MS/MS分析之前，去除干扰物质并进行有效的蛋白质消化至关重要。
2021年4月Kamil Mikulá?ek在期刊《Frontiers in Plant Science》发表一篇题为：“SP3 Protocol for Proteomic Plant Sample Preparation Prior LC-MS/MS”的文章。通过比较植物样本的4种制备方法，包括滤过辅助样本制备 (FASP) 、2种单罐固相增强样本制备（SP3 Carboxy和SP3 HILIC）和蛋白质悬浮捕获 (S-Trap) ，运用LC-MS/MS分析，在蛋白和多肽鉴定数量、蛋白质组覆盖率、重复性、处理时间、单位试验成本等方面以评估它们在去除SDS和蛋白质消化方面的效果。研究对象是拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 。
四种蛋白质组样本制备方法
FASP：过滤辅助样本制备，将样本溶液通过30kDa截留超滤膜，去除低分子量杂质，然后在膜上进行蛋白质消化。
SP3 Carboxy：单罐固相增强样本制备，使用羧基修饰的磁珠进行蛋白质结合和清洗，然后直接在磁珠上进行蛋白质消化。
SP3 HILIC：单罐固相增强样本制备，使用亲水相互作用色谱磁珠进行蛋白质结合和清洗，然后直接在磁珠上进行蛋白质消化。
S-Trap：蛋白质悬浮液捕获法，使用石英滤膜捕获蛋白质悬浮液，去除杂质，然后进行蛋白质消化。
研究结果
01
肽段回收率及蛋白鉴定数量和变异性比较：
SP3 Carboxy方法的肽段回收率最高，且鉴定鉴定到的蛋白组数量较高。FASP仅次于SP3 Carboxy，SP3 HILIC方法略低，S-Trap方法最低。且连续添加胰蛋白酶有助于提高回收率，但消化时间对SP3 Carboxy方法影响不大。
图1、图2：展示了4种样本制备方法在处理60 μg拟南芥总蛋白时，肽段回收率与消化时间的关系以及鉴定到的蛋白组数量和变异性的比较
02
低样本输入量下使用SP3 Carboxy方法制备：
对于低微克量的蛋白质输入，高比例的磁珠:蛋白质比例（如600:1）更有利于蛋白质组鉴定。高比例的胰蛋白酶:蛋白质比例（如2:1）可以降低肽段中不完全切割的比例，提高消化效率。因此，对于1 ug拟南芥总蛋白，推荐使用磁珠:蛋白质比例为600:1和胰蛋白酶:蛋白质比例为2:1，以获得最佳的蛋白质组鉴定结果。
图3：展示了SP3 Carboxy方法处理1 μg拟南芥总蛋白时，不同磁珠/蛋白质比例和胰蛋白酶/蛋白质比例对蛋白质组鉴定数量的影响
03
高样本输入量下使用SP3 Carboxy方法制备：
使用SP3 Carboxy方法处理毫克级 (10 mg) 蛋白质输入时，高比例的磁珠更有利于肽段回收。优化后的SP3 Carboxy方法需要使用高比例的磁珠:蛋白质比例 (10:1) ，以获得最佳的肽段回收率，而胰蛋白酶量对肽段回收率没有显著影响。
图4：展示了SP3 Carboxy方法处理毫克级 (10 mg) 蛋白质输入时，不同磁珠:蛋白质比例和胰蛋白酶:蛋白质比例对肽段回收率的影响
04
SP3 Carboxy和FASP方法在处理不同样本输入量时方法比较：
对于低微克量的蛋白质输入 (≤10 μg) ，SP3 Carboxy方法鉴定到的蛋白组数量显著高于FASP方法。对于较高的蛋白质输入量，两种方法鉴定到的蛋白组数量相似。因此SP3 Carboxy方法在低样本输入量时具有优势。
图5：展示了SP3 Carboxy方法和FASP方法在处理不同蛋白质输入量时，鉴定到的蛋白组数量的比较
05
SP3 Carboxy和FASP方法制备样本后的蛋白和肽段特性比较：
经LCMS/MS分析，Venn图显示了两种方法鉴定到的蛋白质组之间的交集和独特部分。两种方法共有4,821个蛋白质组，占总鉴定蛋白质组的88%，具有很高的重叠性。两种方法的蛋白质组强度分布非常相似，定量重复性很高。鉴定到的肽段的GRAVY指数分布。SP3 Carboxy方法鉴定到的肽段在GRAVY指数上略偏向于亲水性，这可能与SP3 Carboxy方法中使用的磁珠和洗涤条件有关。表明SP3 Carboxy方法可以作为FASP方法的替代方案，特别是在需要快速、高效和成本效益高的蛋白质组学分析时，SP3 Carboxy具有明显的优势。
图6、图7：展示了SP3 Carboxy方法和FASP方法在处理拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 蛋白样品时，鉴定到的蛋白质和肽段的一些特性比较
研究结论
SP3 Carboxy方法是一种高效、经济、操作简便的植物蛋白质组样本制备方法，特别适用于低微克量蛋白质输入。该方法可以有效地去除SDS和其他杂质，实现高效的蛋白质消化，并鉴定到更多的蛋白质组。与FASP方法相比，SP3 Carboxy方法具有显著的成本优势，并且可以显著缩短操作时间。该方法为植物蛋白质组学分析提供了一种新的选择。未来可以进一步优化SP3 Carboxy方法，例如开发自动化流程，提高方法的通量和效率。有望促进植物蛋白质组学研究的快速发展，并推动相关领域的研究进展。
SP3方案在不同样本输入量的快速Protocol
01
经典SP3方案（适用于0.1-100μg蛋白质输入）：
蛋白质提取：将植物组织粉末溶解于SDT缓冲液 (4% SDS，100 mM DTT；100 mM Tris-HCl，pH 7.6) 中，离心去除不溶性物质。
甲基化：加入碘乙酰胺进行蛋白质甲基化。
磁珠结合：将蛋白质与羧基磁珠6515和4515混合，让蛋白质结合到磁珠上。
洗涤：用AB缓冲液 (50 mM ammonium bicarbonate，0.1% formic acid) 洗涤磁珠，去除杂质。
蛋白质消化：在磁珠上加入胰蛋白酶进行蛋白质消化。
洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除未消化蛋白质。
收集肽段：用AB缓冲液洗脱肽段，收集肽段溶液。
02
大样本量SP3方案（适用于毫克级蛋白质输入）：
蛋白质提取：将植物组织粉末溶解于SDT缓冲液中，离心去除不溶性物质。
甲基化：加入碘乙酰胺进行蛋白质甲基化。
磁珠结合：将蛋白质与羧基磁珠6515和4515混合，让蛋白质结合到磁珠上。
洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除杂质。
蛋白质消化：在磁珠上加入胰蛋白酶进行蛋白质消化。
洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除未消化蛋白质。
收集肽段：用AB缓冲液洗脱肽段，收集肽段溶液。
额外洗涤：用AB缓冲液额外洗涤磁珠，收集肽段溶液。
混合：将收集的肽段溶液与额外洗涤液混合。
保存：将混合后的肽段溶液保存于-80°C备用。
产品信息
磁珠种类 | 浓度产品 | 规格 | 货号 |
Sera-Mag SpeedBead 羧基磁珠 (E5) | 5% (50mg/mL) | 15ml 100ml 1000ml | 45152105050250 45142105050350 45152105050450 |
Sera-Mag SpeedBead 羧基磁珠 (E7) | 5% (50mg/mL) | 15ml 100ml 1000ml | 65152015050250 65152105050350 65152105050450 |
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参考文献：
Wi?niewski, J., Kowalska, K., Horáková, R., Hroudová, J., & Zeleny, Z. (2021). SP3 Protocol for Proteomic Plant Sample Preparation Prior LC-MS/MS. Journal of Proteome Research, 20(4), 1936-1945.
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