VZV、RSV等CHO重组蛋白膜过滤技术应用之除菌过滤篇

2024-04-13756

在生物制品生产制造过程中，除菌过滤技术是一种通用的、有效的微生物控制手段，在无菌药品生产中具有广泛应用。对于无法最终灭菌的药品，通常采用除菌过滤技术来保证无菌药品的安全、有效和质量稳定。在本期内容中，我们将着重介绍除菌过滤技术在CHO重组蛋白疫苗中的应用。

除菌过滤的法规要求

除菌级过滤器的定义

1987版FDA《无菌药物工业指南》将除菌级过滤器定义为“当用至少达到10⁷/cm²过滤面积浓度的缺陷短波单胞菌 (P. diminuta) 进行挑战，可以产生无菌滤出液的过滤器”。《除菌过滤技术及应用指南》（2018年第85号）也提出“根据ASTM838-15，用挑战水平大于等于1×10⁷cfu/cm²有效过滤面积的缺陷型假单胞菌对过滤器进行挑战，经过适当验证，可以稳定重现产生无菌滤出液的过滤器”。

这里需要强调的是虽然除菌级过滤器的滤膜孔径通常选用0.2 μm或者0.22 μm，但是无菌过滤的精度选择重点是看细菌截留挑战的验证结果，而不仅仅是看精度，精度只是一个表述。

除菌级过滤器的验证

除菌过滤验证包含除菌过滤器本身的性能确认和过滤工艺验证两部分。两者很难互相替代，应独立完成。除菌过滤器本身的性能确认一般由过滤器生产商完成，主要的确认项目涉及滤器的一些固有属性，包含微生物截留测试、完整性测试、生物安全测试（毒性测试和内毒素测试）、流速测试、水压测试、颗粒物释放测试和纤维脱落测试等。过滤工艺验证需要结合具体的待过滤介质，特定的工艺和操作条件做验证，需要由制药企业主导完成。一般包括细菌截留试验、化学兼容性试验、可提取物或浸出物试验、安全性评估和吸附评估等内容。如果过滤后，以产品作为润湿介质进行完整性测试，还应进行相关的产品完整性测试验证。

除菌过滤器的选择及应用

除菌过滤器的选择

无菌药品生产的全过程需要进行微生物控制，避免微生物污染。最终除菌过滤前，待过滤介质的微生物污染水平一般小于等于10 cfu/100 ml。

过滤效果通常取决于料液本身的特性、选择的滤器和工艺参数的设定，料液的浓度、粘度、pH、与滤器的兼容性、操作的压力、流速、温度等等都是影响过滤效果的因素。

在选择过滤器材质时，应充分考察其与待过滤介质的兼容性。过滤器不得因与产品发生反应、释放物质或吸附作用而对产品质量产生不利影响。

除菌过滤器不得脱落纤维，严禁使用含有石棉的过滤器。常见的液体过滤膜材有尼龙 (Nylon) 、聚醚砜 (PES) 、聚偏二氟乙烯 (PVDF) 等。

尼龙 (Nylon) 亲水性较好，与蛋白结合能力较强，因此不适用于蛋白料液。

聚醚砜 (PES) 得膜材有着出色的高流速和高通量得特点，有很好的pH兼容性及活性成分蛋白质高透过能力，能够高效过滤进料。

聚偏二氟乙烯 (PVDF) 材质的滤器在工艺特定验证研究中表现出极低得可提取物及极低得蛋白吸附率，常用于大分子药品终端过滤。

在考察了滤膜的材质与料液兼容的基础上，还需评估过滤载量与过滤通量，对于复杂及较污堵得料液选择载量高得滤膜可以有效提高单位面积滤膜处理能力、降低滤膜使用面积及减小滤膜死体积，保证除菌工艺得顺利进行。而过滤通量得提升可以有效降低过滤时间。过滤载量及通量通常与开孔率、膜材、孔径、结构设计等密切相关。新月形打褶相较于传统得星型打褶（如图1）可以有效提高滤芯单位膜面积，增加滤膜承压能力，减少滤芯使用数量。

图1. 星形打褶和新月形打褶的对比

Supor EKV PES除菌滤膜可做成不对称的结构（如图2），在单张滤膜上实现预过滤层及终过滤层，渐变得预过滤层可以有效提高膜容污能力，提升膜载量。

确定了膜材及产品选择后，还需考虑选择滤器的形式以及灭菌方式。滤芯形制需要配合不锈钢滤壳使用，可以进行高压蒸汽灭菌及SIP；囊式滤器本身已经有塑料外壳，可直接使用，根据需求选择预灭菌或者非预灭菌得形式并根据灭菌方式（高压蒸汽灭菌或SIP）选择合适得产品。

图2. 除菌滤器上下层电镜图（左），上层结构为对称孔径对杂质的拦截（中），上层结构为不对称孔径对杂质的拦截（右）

除菌过滤器的应用

目前市场上出现了众多的新型疫苗生产平台，例如新佐剂疫苗，mRNA疫苗，重组蛋白疫苗等等，进一步加速了疫苗的发展。针对CHO重组新型疫苗，可优先尝试 Supor EKV PES除菌滤膜，独特的打褶形式和制膜工艺，增加了有效过滤面积，使处理相同体积料液时所需的工艺时间更短，滤器尺寸更小。规格齐全，能满足从小试到生产放大的需求。

图3展现了CHO细胞表达重组蛋白发酵液经过澄清之后 Supor EKV PES除菌滤膜的除菌效果。蛋白浓度3.5 mg/ml，过滤过程中滤速平稳，可达到3000 LMH，压力缓慢上升，压差0.7 bar时载量已大于2400 L/m²，收率100%。