构建分子信标检测解螺旋酶活性的高通量筛选体系

该文描述了一个基于荧光检测的高通量解螺旋酶活性筛选系统，并利用该系统测试了HCV病毒NS3解螺旋酶对DNA及RNA底物的解螺旋活性监控本系统采用一个人工合成的寡聚双链DNA分子信标为底物该底物双链分子中的短链（信标链）的一端连接一个荧光基团，在另一端则连接一个荧光猝灭分子；信标链进一步同一个更长的DNA或RNA寡居核苷酸结合形成稳定的双链底物该底物分子在解螺旋酶和ATP的作用下双链打开后，信标链形成分子内发夹结构，荧光基团同猝灭基团靠近而引发荧光猝灭因而检测荧光猝灭即可监控解螺旋酶的活性变化不同于传统的是螺旋酶活性检测方法，本方法是不可逆的；因此在测定过程中也无须加入额外的DNA单链以防止解链后的底物再次结合该文作者构建了若干种基于不同荧光分子的反应体系，包括Z常用的Cy3和Cy5染料分子文中也介绍了基于该技术的高通量筛选应用Tecan的Infinite M200多功能酶标仪被用于反应体系的荧光检测；其结果表明，在384孔微孔板格式下，Infinite M200提供的高灵敏度能够实现稳定的高通量筛选，筛选体系的Z（评价筛选体系的稳定性及可靠性的数字指标）可达到0.7以上 Infinite® 200 Pro多功能微孔板检测仪