Cell重磅，胶质母细胞瘤如何实现“免疫逃逸”，100%单细胞分选技术助力细胞系构建！

胶质母细胞瘤（GBM）在基因组、转录组和表观遗传层面上表现出高度的肿瘤内和肿瘤间异质性。GBM与肿瘤免疫微环境之间的相互作用在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。然而，GBM如何促进肿瘤免疫微环境的机制仍然不清楚。英国爱丁堡大学再生医学中心的Steven M. Pollard团队^[1]通过体外试验和动物模型发现，胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cell, GSC）通过表观遗传途径进行免疫编辑，促进髓系细胞的招募，形成富含髓系细胞的肿瘤微环境，从而实现免疫逃逸并促进肿瘤进展。

本文中细胞分选及细胞系的构建均采用单细胞可视化分选培养系统isoCell。该系统可确保分选出的细胞100%为单细胞，可以实现高通量、自动化、高成活率的单克隆细胞系构建、微生物分选与培养、单细胞分选、单细胞组学等功能。

单细胞可视化分选培养系统isoCell

研究者在BL6小鼠的神经干细胞中分别引入了五种已确定的GBM驱动突变（包括EGFRvⅢ过表达、PDGFRA过表达、以及NF1、PTEN和TP53的基因敲除）（图1A）。随后，研究者将这些突变组合在一起以模拟GBM。他们通过同时敲除NF1和PTEN并过表达EGFRvIII，形成了带有三重突变的NPE细胞系（图1B-C）。在这种细胞系中，可以观察到小鼠体内出现侵袭性的肿瘤生长和浸润（图1D），以及GBM的典型特征（图1E-H），可以用其来模拟肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）的相互作用。为了对照，研究者在免疫缺陷的NSG小鼠中平行生成了相应的肿瘤（图1I）。NPE肿瘤能够诱发BL6小鼠的免疫反应，在BL6小鼠中的生长速度比在NSG小鼠中更慢（图1J），而且大多数BL6宿主能够在肿瘤检测不到的情况下长期生存（图1G）。这些数据表明，BL6小鼠的宿主免疫系统对NPE细胞产生了反应，并限制了肿瘤的生长。

图1 工程GSC在连续移植中获得免疫逃逸能力

因此，通过对肿瘤细胞进行连续移植后的原代培养，可以富集获得免疫逃逸能力的细胞。研究者在进行三轮BL6小鼠移植及其肿瘤原代培养后，发现NPE-IE细胞表现出更强的肿瘤形成能力（图1I），并且小鼠的生存期显著缩短（图1J），这表明NPE-IE细胞获得了免疫逃逸的能力。这与免疫编辑的概念相符，即宿主的持续免疫攻击导致了具有更强免疫逃逸能力的细胞的出现。

为了揭示NPE-IE细胞获得免疫逃逸能力的内在机制，研究者将NPE细胞和NPE-IE细胞分别与野生型NSCs进行了对比。然而，通过核型分析和全基因组测序，结果显示无论是倍性、结构还是点突变都没有显著异常（图2A），这表明NPE-IE肿瘤的获得性免疫逃逸并非源于克隆进化或经典的遗传免疫编辑过程。进一步的转录组分析发现，转录因子Ccl9和Irf8的高表达可能与“训练”免疫逃逸有关（图2B、2F）。既往研究已表明，Ccl9与致瘤性微环境的建立有关，这可以解释NPE-IE肿瘤中髓系细胞的增加；而Irf8表达的上调则令人意外，因为它作为髓系特异性转录因子通常仅在造血细胞中表达，参与髓样细胞和巨噬细胞的分化。综上所述，研究者发现机体对NPE细胞的免疫攻击可以引发肿瘤显著的转录改变。

图2 免疫逃避细胞在免疫攻击后进行了显著的转录重组

研究者还发现，肿瘤细胞中许多基因的去甲基化与免疫逃逸有关（图3D）。最显著的甲基化变化出现在Irf8的启动子和编码区，其低甲基化与转录活性的增加相一致（图3D-E）。

图3 NPE-IE细胞的免疫逃逸特性通过表观遗传免疫编辑而强化

巨噬细胞可以通过干扰素γ（IFNγ）诱导的STAT1信号通路来引发Irf8的表达。研究者通过体外实验发现，来自免疫肿瘤微环境的慢性IFNγ信号可能会刺激NPE细胞中Irf8的表达激活（图4B-C），且这种激活与Irf8位点的DNA去甲基化状态相一致。JAK/STAT抑制剂托法替尼未能逆转NPE-IE细胞中IRF8的表达，这表明在NPE-IE细胞中，维持Irf8高表达的机制是不依赖于JAK/STAT的（图4D）。

图4 Irf8对IFNγ及TAM信号的应答在免疫逃逸中有重要作用

经过IFNγ处理后，NPE细胞中关键基因（如Irf8、H2-Ab1）出现了广泛的激活（图4E）。研究表明，浸润的巨噬细胞群（F4/80+，CD45hi）可能会刺激免疫原性NPE细胞发生上述转录变化（图4F），这表明肿瘤浸润巨噬细胞可能是TME中IFNγ的主要来源。

研究者使用iotaSciences的单细胞可视化分选培养系统isoCell分选并培养了NPE-IE Irf8敲除细胞，随后构建了相应的细胞系。NPE-IE Irf8敲除细胞系的肿瘤发展动力学与移植了NPE-IE细胞的小鼠相似（图4H-I），证明Irf8的激活是NPE-IE细胞免疫逃逸的重要因素，并且这种激活可能通过体内的IFNγ信号介导。

文中使用的单细胞可视化分选培养系统—isoCell采用GRID技术，在培养皿上雕刻出单独的细胞腔室阵列，并将单个细胞以纳升体积全自动地分配到各个GRID单细胞腔室中。isoCell自带的成像系统，可确保分选出的细胞100%为单细胞。isoCell可以将单细胞在GRID中培养成单克隆细胞系，培养过程中可以根据客户需求进行换液操作，全流程可视化监控以保证每个单克隆细胞系均来自所挑选的单个细胞。