合成多肽的反相纯化 | 艾塞那肽纯化案例

2024-05-1196

合成多肽的粗品纯化通常采用多步纯化过程。第一步除去大多数杂质，然后是通过二次精纯以达到所需的纯度。如果工艺合适，单步纯化即可完成的话，可以节省大量时间和成本达到必要的纯度，同时保持理想的收率和上样量。如果使用相同的固定相进行多步纯化，与使用多种固定相相比，也可提供可观的时间和成本的节省。

当采用多步色谱纯化时，常规构思是使用两种或两种以上的互补模式色谱，比如离子交换凝胶渗透、亲和，和反相配合，以利用它们不同的选择性。改变固定相是一个获得不同的选择性的有效方法，但这会让大批次的纯化成本提高，耗时增加。通常来说，多肽的性质允许调整pH值或选择不同的有机溶剂以达到改变选择性的目的，而这些改变的成本相对较低而且很容易实现。

艾塞那肽（Exenatide）纯化案例

艾塞那肽（Exenatide）是一种由39个氨基酸组成的多肽类胰高血糖素激动剂，于2005年4月被批准用于治疗糖尿病2型，化学结构如图1所示。

图1.艾塞那肽的化学结构式

Luna 10μm-PREP C8的流动相筛选

艾塞那肽是相对非极性的，首选Luna C8作为固定相，并用乙腈作为强溶剂。目标物的等电点为4.38，包含6个酸性侧链和4个碱性侧链，推断pH值变化可能改变艾塞那肽及其相关杂质之间的选择性。初步筛选评估4种不同的水相【pH值范围为2-8】(图2)。

色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100?

规格：250x4.6mm

货号：00G-4623-E0

流动相：

A: 如图所示

B: 100%乙腈

流速：1.5mL/min

进样量：10μL @ 40mg/mL

温度：室温

波长：UV @ 220nm

梯度：B在10分钟内从25%变成45%，然后在1分钟内从45%变成70%，70%B保持1分钟

图2.不同pH条件下的初步筛选结果

图3.不同pH洗脱液的优化梯度

图4.不同流动相的筛选结果

色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100?

规格：250x4.6mm

货号：00G-4623-E0

流动相：A: 如图所示；B: 100%乙睛

梯度：如图所示

流速：1.5mL/min

进样量：40μL @ 40mg/mL

温度：室温

波长：UV @ 220nm

色谱柱：Kinetex 5μm EVO C18

规格：150x4.6mm

货号：00F-4633-E0

流动相：A: 0.1%TFA水溶液；B: 100%乙睛

梯度：B在5分钟内从15%变成30%，然后在0.5分钟内从30%变成50%，50%B保持2分钟

流速：2.0mL/min

进样量：5μL

温度：室温

波长：UV @ 220nm

小试后用Kinetex EVO分析(图4)。可以看到一步纯化没有满足98.5%的纯度，并且期望的Z终产品是醋酸盐，所以在二次精纯时需要使用醋酸盐优化。

结果和讨论

两步法纯化，纯度>98.5%原始原料的纯度估计为66%，使用Kinetex EVO作为分析柱（图5）。第一步进行了简单的上样量研究并在条件下确定了粗品1%上样量没有问题（图6）。收集第一步的主峰馏分收集，进行分析，纯度为96.5%。第二步切换醋酸盐，收集主峰，浓缩冻干，HPLC分析成品纯度为99.3%。