细胞培养的步骤和注意事项

1、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM完全培养基中，轻轻吹匀，离心，弃上清液。加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

2、细胞传代

当细胞密度达到80%~90%（过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂期）时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞Z 好，Z 佳消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

加入适量DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。

加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

3、细胞冻存

当细胞密度达到80%~90%时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入l ml冻存液，放入冻存管内（管内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放入液氮，可以保存三个月。

细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

4、注意事项

（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

（2）用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小；

（5）严格的无菌操作；

（6）贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化；

（7）传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次Z 好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染；

（8）传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。