访谈| 如何从NGS微缩化建库中获益

请问你能介绍一下你自己以及你在公司的角色吗？

我叫Huw Rees。作为北美现场应用科学团队的一员，我为我们液体处理解决方案的用户提供专家培训和应用建议，这些方案包括mosquito?、firefly?和dragonfly?。

NGS中的文库制备是什么，为什么要自动化？

NGS文库制备通常包含几个关键部分，下面列出了需要液体处理的关键步骤：

几乎所有试剂盒都需要进行DNA末端制备，即对末端进行修饰，使其适合后续测序。之后是纯化步骤，以去除初始制备步骤中的酶和其他试剂。

PCR之后，下一步是在将样品放入测序仪之前再次进行纯化。这些试剂盒非常适合自动化，因为手动操作既费力又耗时。特别是对于多孔板来说，手动准备这些试剂盒需要数小时精确、专注的工作，而且很难掌握。

很难找到能够迅速、一致且有效地操作这些试剂盒的有经验的实验室工作人员。自动化这个过程降低了对专业技能的需求并且使科学家能够专注于他们研究的其他部分。

自动液体处理器可以移液的体积低于手持移液器能够处理的体积。使用手持式移液管很难进行微升以下的体积操作，但自动化可以持续稳定地实现这一点。

将NGS文库制备微缩化有哪些好处？这对每个样品的成本有何影响？

将NGS文库制备微缩化很重要，因为它能让您的投资发挥更大的作用。虽然文库制备试剂盒效果不错，但由于其制备涉及的费用（如蛋白质工程和广泛的研究），因此每个样品的成本通常都很高。

通过将这些试剂盒微缩化，您可以显著减少每个反应所需的体积，从而允许您使用相同数量的试剂处理更多样品，从而节省资金。此外，自动化通过提高实验室通量进一步增强了这一点优势。微缩化还减少了您对手动移液的依赖，提供了无人值守的时间，并提高了您工作流程中样品的通量。

实验室如何实现更显著的微缩化？

在高读取深度的试剂盒中可以实现更显著的微缩化。例如，NEBNext Ultra II DNA试剂盒可以在mosquito上缩小约十倍，让您的试剂盒效能提升十倍，从而让您节省成本。其他试剂盒也可以缩小到类似的程度，甚至更多。

您能多谈谈关于mosquito以及它是如何通过微缩化来实现投资回报率（ROI）最大化的吗？

“Mosquito”是我们设计的纳升级液体处理仪器，旨在通过微缩化实现投资回报率（ROI）的最大化。Mosquito的枪头被装载在仪器顶部的针卷上，该针卷将它们送入移液头中。这个移液头可以在五个可用的多孔板架位置上进行吸液操作，支持96孔和384孔两种规格。枪头由不锈钢制成，外层覆盖高密度聚乙烯，确保了耐用性和精度。每个单独的枪头都采用了真正的固相技术，这意味着液体和枪头之间没有空气柱。所以在处理低粘度或高粘度液体时，准确性不会受到影响，因此它可以毫无问题地处理非常粘稠的master mixes或易挥发的混合物，如乙醇。

mosquito 可以处理 500 nL 至 5 μL 的体积，而其低体积型号则能够处理从 25 nL到1.2 μL的体积。在本次讨论中，我将主要关注大体积型号，它具有微缩化磁珠纯化的能力。

枪头的一次性使用几乎消除了交叉污染的可能性。mosquito 能够从孔的最底部实现吸液和分液，保证了可忽略不计的死体积至最低，使基因组 DNA 和酶的处理动作非常柔和。这对于NGS文库制备来说非常重要，因为它避免了泡沫产生和涡旋剧烈等可能破坏酶的问题。

如何使用 mosquito 轻松实现 NGS 文库制备？

mosquito配备了一套全面的软件系统，其中包括用于简化常见 NGS 程序设置的默认向导，如Nextera XT、NEB试剂盒和磁珠纯化。该软件还允许在我们的FAS团队的帮助下进行自定义实验设置，使实验室能够根据其特定需求对试剂盒进行微缩化。用户友好的软件界面允许轻松定制和修改实验。

一个预加载程序的例子是 NEBNext Ultra II FS DNA 试剂盒。你将在“运行”（Run）页面开始，该页面有一个预编写的详细说明，列出了它将执行的步骤，以及一个预估的运行时间。

如果需要定制，你可以从“信息”（Information）页面修改实验参数，该页面提供了程序的标题和描述。这个程序被优化以节省试剂枪头和时间。它还包含了片段化、末端修复、dA加尾、接头连接和USER酶处理的步骤。

“多孔板”（Plates）标签页允许你指定将要使用的多孔板类型。如果有需要，你可以更改这些默认设置。

在“实验”（Experiment）标签页下，如果你运行的样本数量较少，你可以减少多孔板上的所需试剂放置列的数量。你还能够修改各列被放置的位置。例如，您可以将ligation mix移至不同的多孔板列中，以减少死体积。

在将多孔板和样本物理装载到仪器上后，你只需点击运行即可。mosquito 随后会将 fragmentation mix 分配到反应板上，从而完成你的 NGS 文库制备设置。

你能详细介绍一下文库制备后的纯化程序吗？

在完成初始文库制备和DNA末端处理后，下一步是样本纯化，这涉及到使用磁珠纯化程序。mosquito 软件的向导功能从始至终简化了这一过程，提供了一个包含了所有必要详细信息的运行界面。

这个程序涉及五块板：样本板、试剂板、样本板在磁力架上的位置、废液板和洗脱后纯化样本的输出位置。

使用相似的向导功能，用户可以在“多孔板”（Plates）标签页下自定义多孔板的类型，并在“实验”（Experiment）标签页中调整磁珠纯化程序，例如磁珠比例、乙醇洗涤次数以及是否包含乙醇孵育步骤。用户还可以选择运行的样本数量，并为磁珠、乙醇和其他试剂指定所处列的位置。

一旦设置好多孔板，mosquito 会向样本中添加磁珠，并对多孔板进行涡旋振荡和离心。在与样本进行磁珠孵育后，将多孔板放置在磁力架上进行乙醇洗涤步骤，mosquito 会通过添加和移除乙醇来处理。

然后，将多孔板从磁力架上移开，加入洗脱缓冲液以重新悬浮磁珠，然后将多孔板重新放回磁力架上，以确保最终样本中不含有任磁珠。

这个程序只是mosquito支持的众多工作流程之一。我们拥有大量的引用文献和相关材料，支持从始至终的不同程度的微缩化完整NGS工作流程。

你能举个例子说明mosquito如何降低每个样本的成本吗？

市场上两种强大且知名的试剂盒是Illumina Nextera XT和Illumina DNA制备试剂盒。通过使用mosquito，我们始终如一地实现了十倍微缩化——在Nextera XT的情况下更是达到了12.5倍——从而显著降低了每个样本的成本。

例如，使用384孔样本板，您只需处理八块整板就能支付您实验室中mosquito仪器的成本。这意味着您将很快看到投资回报。在一些实验室中，这种高通量水平是很常见的，使得mosquito能够在几周内就收回成本。

您想分享一些有关Mosquito的令人兴奋的更新吗？

我们最近刚刚推出了Mosquito家族的最新成员——Mosquito Gen3。这是迄今为止我们最紧凑、最易于使用的版本，它提供了Mosquito的所有功能，但仅具有三个孔板位置和更小的占地面积。通过Gen3，我们正在降低微缩化的门槛，因此，更多的基因组学研究人员可以从减少NGS体积的成本节约中受益。

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