【CEM MultiPep】SPOT 合成的质量控制

01 什么是SPOT合成？

What is SPOT synthesis?

SPOT 方法由 Ronald Frank 开发，用于在均质膜载体上的不同位点同时合成多肽。该技术的原理是将预活化的氨基酸衍生物的小液滴分配到多孔膜上预定义的位置阵列上。液滴被吸收并形成单独的反应室，用于固相合成中的化学反应。大量不同的点可以排列在一张膜上，并且这些点中的每一个都可以通过相应试剂溶液的手动或自动输送来单独处理。每个区域的点数和点大小由膜的吸收能力和液滴的体积决定。根据基质的特定功能，点大小与合成的特定规模相关。 Ronald Frank Z初使用的滤膜仍然是蕞受欢迎的载体，由改性纤维素滤纸制成。

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽阵列是一种创建大量肽的廉价且方便的方法。它们通过活化氨基酸液滴的沉积在纤维素膜支持物上合成。与之前相比，膜和氨基功能之间的键合在稳定性上得到了改善。它现在对 100% 三氟乙酸稳定，并且在碱性条件下进行试验不会导致肽损失。该键不能被切割以释放肽。肽保持共价连接，因此难以进行质量控制。有几种方法可以获取有关合成质量的信息。

02 合成与表位分析

Synthesize and analyze some epitopes

您可以制造一些您知道在以前的项目中起作用的肽，但这也需要您掌握一些抗体。一种更简单的方法是制作链霉亲和素识别的 Strep-tag。然后可以使用通用的链霉亲和素报告偶联物进行检测。通过截短表位可以实现不同的信号强度或亲和力。Strep-tag II 的完整序列是：NWSHPQFEK，并且可以检测到埋在另一个序列中的 HPQ 核心。

03 耦合报告分子

Couple a reporter molecule

通常在每个合成周期中都有一个乙酰化步骤，该步骤应封顶所有未反应的链。如果出现严重的合成问题，在后面的合成步骤中就会出现完全的封顶，而不会留下任何游离的氨基。因此，N端的报告分子将表明大部分合成是正常的。有用的报告分子有

• 生物素，用简单的普通链霉亲和素-报告基因共轭物检测

• 链霉亲和素报告共轭物也能检测到 N 端的链霉标签II(NWSHPQFEK)。

• 罗丹明染料，像氨基酸一样容易耦合，在日光条件下可见

04 在合成过程中进行一些检查

Perform some checks during synthesis

手册中介绍了在合成过程中观察游离氨基的溴酚染色步骤。简而言之，在溶液中没有碱的情况下用溴酚蓝在 DMF 中的极稀释溶液（1% 溶液，1:100 稀释）对膜进行染色。斑点应显示为淡蓝色，其强度随序列而变化。可将薄膜影印，以永·久记录一些相关的合成步骤。您还可以使用手持式紫外灯来观察合成后的肽。特别是色氨酸序列在这种紫外灯下会发光。这种紫外灯很容易买到而且价格便宜。通常由矿物学家使用或用于验钞。

上图为烟草在 LUYOR-3410 紫外线灯照射下观察到的效果

05 分析一些参考肽

Analyze some reference peptides

您可以切出单个斑点，对其进行氨基酸分析。更好、信息量更大的质控方法是 MALDI 分析。让一些肽在 C 端以 Lys-Gly 结尾。在完全侧链脱保护后切下斑点，用胰蛋白酶去除肽。这样得到的溶液中即使只有百分之几的肽被释放出来，也足以进行 MALDI分析。请注意，如果存在其他 Lys或 Arg 残基，肽也会在内部被切断。如果在第一个循环中引入一个可裂解的连接体(如 Rink 酰胺连接体)，则整个肽都可以用反式脂肪酸释放出来。在这种情况下，必须在侧链脱保护之前将点切割出来并单独处理。释放的量也足以用于 HPLC 操作。

06 一般性评论

General remarks

SPOT 合成的Z佳肽段长度为 10 到 25 个残基。超过这个长度后，质量就会慢慢下降，因为并非所有的肽链都能完全进入。正如 RudolfVolkmer 小组的详细分析所示，纤维外侧较容易获得的肽链甚至可以增长到 50 个残基的长度。在这种情况下，通过 Fmoc-和 Boc-beta- 丙氨酸混合物的耦合，膜的初始负载量至少应减少 10-100 倍。肽的原始负载量通常比抗体结合所需的负载量高出几个数量级，甚至只有很少的正确序列能被检测到。因此，在每个合成步骤中采用良好的封端程序，并通过软件引导的机器人进行可靠的氨基酸分配，在 N 端使用报告染料就可以对合成程序进行简单的验证，让人放心。

07 使用林克酰胺连接剂进行 SPOT 合成的质量控制

QC on SPOT synthesis using a Rink amide linker

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽阵列是一种廉价而方便的大量合成肽的方法。它们是通过沉积活化氨基酸液滴在纤维素膜支架上合成的。与第一份出版物相比，膜与第一个耦合氨基酸功能之间的结合稳定性有所提高。现在，它对 100% 的反式脂肪酸都很稳定，在碱性条件下进行检测也不会导致肽的损失。这种键不能被裂解以释放肽，而是保持共价连接，因此很难进行质量控制。如果在第一个循环中引入了可裂解连接体（如 Rink 酰胺连接体），则整个肽都可以用反式

脂肪酸释放出来。在这种情况下，必须在侧链脱保护之前切出该点并单独处理。

建议程序:

    1. 根据仪器手册设置合成。

    2. 在合成的第一个循环中，将 FMOC-Rink 酰胺连接物引入所需的质控肽。***质控肽可在膜角附近合成，以便于去除。

    3. 合成后，从仪器上取下干燥的膜并观察斑点

• 使用手持式紫外线灯Z容易做到这一点。然后用铅笔圈出质控点，再从膜上剪下。

• 或者，为了使斑点显现出来，可将膜浸泡在 DMF 溶液中的1% 溴酚蓝中。斑点应呈现淡蓝色，其强度随序列而变化。

    4. 将切下的质控点放入 1.5 mL 螺旋盖微量离心管（或类似试管）中，加入 150 uL 通用裂解混合物（或自选混合物）。盖紧试管盖，培养 2-4小时。这将使肽从各自的林克酰胺连接体上裂解，并去除侧链保护基团。

    5. 将含有已裂解多肽的上清液转移到一个新的微量离心管中，并丢弃装有已用斑点的离心管。

    6. 使用标准实验室程序将溶液完全干燥（应注意强酸和实验室设备）。

    7. 用 10 uL 0.1 % 的反式脂肪酸重溶干肽。

    8. 对该溶液进行 MALDI分析，基质一般为1μL 或更少。(注意 MW为 -1)

注：三氟乙酸(TFA)是一种挥发性很强的酸。整个裂解和加工过程必须在通风橱中进行。在此阶段必须佩戴安全眼镜、手套和白大褂，并遵守所有安全规定。所有废物必须按照国家规定进行处理。

通用裂解混合物

• 92.5%(vv)三氟乙酸，TFA

• 5% (v/v) 三异丙基硅烷

• 2.5% (vv) 水

用于可裂解点的 Fmoc 链接器

Su et al.

Epigenetics&Chromatin volume 7, Article number:7(2014)，组合 PTM 组蛋白肽微阵列合成使用 RespepSL 自动合成器(Intavis AG，KoIn，Germany,MultiPep 1CEM)在改性纤维素上合成肽。将Fmoc从 celluspot 中移除并耦合 Cy3(Lumiprobe,公司)后，就得到了纤维素-Cy3 染料共轭的斑点对照。空白细胞色斑对照组是通过去除色斑上的 Fmoc 并将试纸置于溶解条件下而制成的。对于肽，初始偶联包括等摩尔量的Fmoc-Ala-OH 和 Boc-Ala-OH，以减少树脂负载并提高合成质量。每次合成的肽都含有可被酸裂解的链节，以便通过高效液相色谱法和质谱法进行质量评估(附加文件 12:表 S2)。此外还加入了 20 原子的聚乙烯连接体(PE)(Novabiochem 公司)，以提高合成效果和阵列中的蛋白质结合力。Fmoc-Glu-(biotinyLPEG)-OH(Novabiochem)是链霉亲和素的对照。

使用标准的 Fmoc/tBu 化学方法生成 13 氨基酸肽。如前文所述 [24]，肽的 PTM 以适当保护的单体形式引入。合成完成后，用 82.5% 的三氣乙酸(TFA)去除侧链保护基团:5% 硫代苯甲醚5% 水:5%二氯甲烷中的饱和苯酚:2.5%乙烷二硫醇，持续 90 分钟(每个点150μ)。取出溶液，换上 250 μ的 88.5% 反式脂肪酸、4% 三氟甲磺酸、2.5% 三异丙基硅烷和 5% 水，轻轻搅拌过夜以溶解纤维素。用冷的二乙酉迷沉淀肽纤维素共轭物两次，晾干几分钟，然后重新溶解到100μ 的二甲基亚砜(DMSO)中。

Boisguerin et al.

Chemistry & Biology, Vol. 11, 449–459, April, 2004，我们用与 PSD-95 PDZ3-结构域结合的多肽 NYKQTSVCOOH 测试了硫醚环化的效率[148]。溴乙酰化肽(10)(粗体数字 10-12 参考图 3.5 (A))是在几个可裂解点上合成的(通过加入Fmoc-Rink 连接器实现可裂解性)。3 小时后，用反式脂肪酸将肽产物 h-1、h-2 和 h-3 从点上裂解，并用 HPLC 和 ESI-MS 进行分析(图 3.5 (B))。对反应产物的分析清楚地表明，在 h-3 条件下，硫醚-环化反应的效率很高。为了确定肽序列对环化清除步骤的影响，我们又合成了两种膜结合溴乙酰化肽:EFHAALGSYVCOOH和 QHIDSQKKACOOH。

关于点合成的常见问题

1. SPOT 合成的时间是什么时候?

使用双偶联方案合成 4x384 肽时，每个周期需要 2 个小时，Z后处理需要 2-3 个小时。每个周期的操作时间约为 30 分钟，用于制备活性衍生物和清洗膜。

2. 膜上肽的密度是多少?

标准密度为 10x15 厘米纤维素膜片上 600 个肽网格，中心到中心的距离为 4.2 毫米。也可以自由定义其他网格。在非常受控的条件下，纤维素膜上的密度可达 25x40 个点。

3. 一个点有多少肽?

我们提供的膜经过衍生处理后，游离氨基的负载量约为 300-400 nmol/cm2。每个斑点的负载量可通过面积计算得出。

例如:一个直径为6毫米的点约有 80 纳摩尔的肽，一个直径为3 毫米的点约有 20 纳摩尔的肽。

4. 在 CelluSpots 合成过程中，应选择哪种品牌的滤纸放在框架下?

建议使用 Whatman 540 或 541

5. 乙酰化赖氨酸如何用于合成?

获取 Fmoc-LyS(Ac)-OH，CAS#159766-56-0，并按照与 MultiPep 1&2 相同的标准偶联方法进行偶联。

6. Ahx连接剂的亲水性对应物是什么?

建议使用 Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸。

7. 如何提高小规模滤板合成的产量?

使用 Ramage 树脂(PC-01-0601)，用小容量裂解鸡尾酒可立即裂解肽。

8. 如何使用 MultiPepRSi 或 RespepSL 合成 PNA 使用以下设置:

PNA 单体：0.3M 在 NMP 中使用新型偶联剂

活化剂：HATU 或 PyAOP(0.6M 溶液);HATU 更稳定，PyAOP 应每天更新。

碱混合物：DIPEAV2,6-lutidine(1.2/1.8M，DMF 中)，两种碱在 DMF 中的混合比例为20.09%(vvv)。

9. 如何减少消旋化?

在所有合成的肽中，外消旋化约占 1%。消旋化会使肽更加稳定，从而导致错误折叠。苯丙氨酸和组氨酸会发生消旋化。组氨酸在 50C 或更高的温度下很容易发生消旋化。DIC 和 OxymaPure 的组合可减少消旋化。PyOxim 和 NMM 的组合更易发生消旋化，但不如 HBTU 和 NMM 的组合。

10. 如何减少脱保护过程中天冬氨酸的形成?

在整个合成过程中，用 20% 的哌啶在 DMF（含 0.1M HCOOH）中对 Fmoc 基团进行脱保护，以避免天冬酰亚胺副反应。

11. 如何从 SPOT 膜上裂解多肽?

使用 Fmoc 链接剂作为第一个氨基酸。切出所需的点并涂上裂解液。Rink-Linker 会自行裂解并生成 C 端酰胺。

12. 我的 SPOT 肽中有一部分 N 端酰胺被乙酰化了。如何避免这种情况?

Z后一个氨基酸使用叔丁氧羰基氨基酸。这样可以避免滤纸和滤纸下方通道中的微量醋酸酉干造成乙酰化。

13. 溶解了 NMP 的氨基酸可以保存多久?

除半胱氨酸和蛋氨酸外，氨基酸溶液可在 4℃ 下保存一个月。请注意，如果粉未变质，丙氨酸和谷氨酸会产生沉淀。