分子相互作用相互仪（MP-SPR）在奶粉细菌检测方面的应用

       食品致病菌污染是严重威胁人类健康的问题，用于快速、准确控制食品质量的生物传感器得到了广泛的研究。

       建立了基于多参数表面等离子体共振(MP-SPR)生物传感器检测乳制品中鼠伤寒沙门菌的方法。利用生物催化沉淀法进一步改进了利用捕获抗体直接检测细菌的方法。对照样品的检出限(LOD)为10² CFU/mL， 真实样品(奶粉)的检出限为10³ CFU/mL，表明该生物传感器具有较高的灵敏度。

概述

       目前使用的沙门氏菌检测方法包括培养、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR) 。这些方法通耗时，需要复杂的样品预处理和训练有素的人员，因此正在积极开发更强大和易于使用的方法。

       表面等离子体共振(SPR)是一种成熟的方法，用于测量结合亲和力和动力学。创新的多参数表面等离子体共振(MP-SPR)仪器可以在非常宽的角度范围(40-78度)和多个波长进行测量，从而允许从小分子相互作用到细菌，细胞和病毒的实时检测的广泛应用。

       MP-SPR是生物传感器开发的无与伦比的方法，无论您的传感器是基于MP-SPR检测还是您正在开发新的便携式(护理点)生物传感器。MP-SPR的优点是灵敏度高，无标记检测。它还允许直接在您选择的材料上开发传感器:金属电极电化学、孔板分析用塑料、印刷生物传感器用纤维素、传统化学用玻璃、SERS纳米粒子等，避免分析转移步骤。传感器载片可以很容易地在原位和非原位进行修改，提供了广泛的功能化可能性(CVD, ALD，自旋涂层，浸渍涂层等)。此外，MP-SPR允许测量真实样品(牛奶，100%血清，尿液，海水等)，不像许多传统的SPR仪器。在MP-SPR测量后，可以用AFM等其他方法进一步表征传感器表面。这得益于MP-SPR的无油操作，使用了涂有光学弹性体的棱镜。

材料和方法

       本研究采用BioNavis MP-SPR Navi™210 VASA仪器，流速为20 μL/min。用2 M NaCl和10 mM NaOH溶液清洗CMD3D传感器载玻片5分钟，然后用EDC (200 mM)和NHS (50 mM)的混合物活化羧基7分钟。引入捕获抗体(和BSA作为参考通道)(10 μg/mL，在50mM醋酸缓冲液中，pH 4.5)，然后用乙醇胺(1 M, pH 8.5, 5分钟)阻断剩余的反应基团。为了进一步阻断，注射牛血清白蛋白(2 mg/mL, HBS-P)和1%奶粉，HBS-P。

       将奶粉(Laktino)用HBS-P缓冲液稀释至1%的浓度。不同浓度的肠沙门氏菌(亚种)。经培养和热处理(80°C/30min)后加入样品中。处理过的细菌浓度以CFU/mL表示，对应于处理前的活细胞。

       细菌注射10分钟，然后注射10分钟辣根过氧化物酶抗体偶联物(HRP- ab2)和沉淀底物溶液(HRP)(图1)。生物催化反应将4-氯-1-萘酚转化为不溶性苯并4-氯环己二酮。检测限(LOD)是根据信噪比来评估的，其中可测量的Z小信号电平必须比噪声电平高三倍。

图1所示。多参数表面等离子体共振(MP-SPR)检测奶粉中沙门氏菌。辣根过氧化物酶抗体2 (HRP-Ab2)特异性结合沙门氏菌和沉淀物的形成。

结果和讨论

       该生物传感器首先在Biacore 3000 SPR仪器上开发，LOD达到10⁴ CFU/mL。为了进一步改进生物传感器，选择了生物催化沉淀反应来提高灵敏度。然而，辣根过氧化物酶需要使用乙醇。Biacore仪器与醇不兼容，不像BioNavis MP-SPR仪器，它对有机溶剂具有优异的抵抗力。因此，选择MP-SPR Navi™210A VASA进行进一步研究。

       利用MP-SPR仪器，成功开发了一种生物传感器，生物催化沉淀将沙门氏菌检测限(LOD)从10⁴ CFU/mL提高到10² CFU/mL(图2)。在含有捕获抗体和细菌的通道中，结合水平很高，而在参比通道(处理过的BSA)中仅形成少量沉淀。沙门氏菌结合多个HRP-Ab2偶联物，随着微生物浓度的增加，生物传感器的灵敏度呈指数级提高。与直接结合法相比，HRP-Ab2结合物对沙门氏菌具有特异性，也提供了更高的选择性。该传感器与革兰氏阴性菌大肠杆菌K-12的交叉反应性测试表明，其结合可忽略不计。以MP-SPR传感器载玻片的光学显微镜和AFM图像为参照，均证实生物传感器表面有细菌附着和沉淀形成(图3)。

图2。沙门氏菌的检测是基于抗体(HRP-Ab2)与细菌的结合和辣根过氧化物酶的生物催化沉淀。几个HRP-Ab2结合在一个细菌上导致信号呈指数级扩增。

图3。缓冲液中不同浓度细菌引起的生物催化沉淀(上图)和实际样品奶粉中的细菌检测(下图)。原子力显微镜图像证实了细菌附着和沉淀物的形成。

       MP-SPR的总分析时间为60分钟，明显短于其他细菌检测方法，如培养(~d)、ELISA (~10 h)和PCR (~h)。

       细菌的结合不仅对生物传感器的发展很有意义，而且对材料科学也很有意义。MP-SPR已被用于表征功能性“自卫”抗菌植入物涂层(Cado et al.， 2013)。涂层通过病原体刺激释放抗微生物肽。在这里，MP-SPR测量多层膜的形成并量化吸附质量。

结论

       MP-SPR是一种高灵敏度、高选择性的生物传感器，可用于检测食品样品中的细菌。例如，MP-SPR对于食品和饲料安全、环境安全、临床诊断、边界和过程控制等方面的检测开发具有不可估量的价值。在生物传感器开发中使用MP-SPR的主要好处是: 与有机溶剂的相容性，易于修改传感器表面，能够处理原始样品