肿瘤治疗学中 3D 细胞球的高内涵成像

背景介绍
近年来，将体外肿瘤细胞聚集物作为模拟体内组织环境模型的技术得到了重大的突破。该项技术能够使种植在低吸附圆
底孔板中离散的细胞聚集成球体。而球体被认为能够比常规的二维 (2D) 细胞培养更有效地模拟肿瘤行为。因为与肿瘤实
体类似，3D 细胞球也包含暴露在球面的细胞和深埋在球内的细胞、都含有增殖和非增殖的细胞，并且球体中心是一个缺氧环境。越来越多的实例已成功地将这种三维球体模型用于各种用途的化合物筛选，以研究潜在的癌症疗法。然而要获得这类 3D 球体分析的可靠方法时，是具有挑战性的：
• 定位聚焦在一个视野中即可看到完整的球体，以便对每个孔进行批量成像。
• 优化化合物和染色处理，确保染料渗透效果，避免干扰球体的位置。
• 在整个 3D 结构中获取具有代表性的图像，Z大限度地减少成像平面上下的失焦和背景信号。
• 快速分析图像以产生有意义的结果，从中可以得出实验结论。

主要特点
• 在 20 倍物镜下只需要一个视野即可获得完整的球体。
• 支持在 96 孔板或者 33D 成球实验。

• 使用共聚焦成像精确检测细胞反应。

• 可通过只保存 z 平面图像的 2D 投影来节省存储空84 孔板中进行 间。

球体形成和处理
我们使用下面的方法来对肿瘤细胞系 HCT116,DU145 和HepG2 进行细胞成球。在 37℃ 和 5%CO2 条件下，细胞在培
养瓶中培养。然后消化，并使用含有适当浓度胎牛血清的细胞培养基重悬细胞。然后以每孔 1000-1500 个细胞的浓度将细胞悬液铺设在 96 孔或 384 孔 U 型底的黑边底透板中，可使用 Corning 4520 和 3830 两种型号的板材。培养 24 小时后，每孔底部细胞开始形成单一的球体。继续在 37℃ 和 5%CO2 条件下连续培养细胞 2-4 天，直至细胞球尺寸符合实验要求 ( 图 1 )。球体可以培养更长的时间，但球体过大会阻碍染色渗透，以致Z中心细胞无法成像。
本应用手册描述了用于测定anticancer化合物 ( 依托泊苷、紫杉醇和丝裂霉素 C ) 效果的分析方法。球体处理过程首先在孔中加入浓度为 10 倍的化合物，然后孵育 1-4 天，这取决于所研究的药物作用机理。较短的药物作用时间用于研究细胞凋亡，较长的药物作用时间用于多参数细胞毒性研究。对于超过 2 天的药物处理，化合物以 1 倍浓度每 2 天更换一次。

球体染色和成像
这里举例来源于优化的 HCT116 球体分析，该方法用于评估球体形态变化以及球中凋亡细胞的发生率。在完成药物化合
物处理过程后，所有染料混合在一起，以 4-6 倍浓度的条件直接加入到每孔中进行染色。染料无需洗涤过程，以避免对细胞球的位置和完整度的影响。
使用 ImageXpress 共聚焦高内涵成像系统的 10 倍或 20 倍物镜对球体进行成像。为了分析细胞在整个三维结构中的反应，我们从球体内部不同 Z 轴深度收集图像，以创建一个“stack”图像。然后使用数学算法将这些图像组合或“ 堆
叠 ”成一个二维投影图像。该算法使 stack 中每一层图像中亮度Z高的像素保持在生成投影的图像中 ( 图 2 )。

ImageXpress 共聚焦成像系统可生成更清晰的图像，以实现更精确的 Z 轴分割
在对球体进行 Z 轴成像方面，共聚焦成像比宽场成像提供了更薄的 Z 轴切层。这大大减少了被采集平面上方和下方荧光
发射物体产生的背景干扰而产生的光晕效果。它还提供亚细胞水平或细胞之间的精细细节的更好分辨率。使用共聚焦成
像通常可以实现更精确的分割。在对球体的重复实验中，从宽场图像中分割出的细胞核数量比共聚焦图像中的细胞核数量低约 20% ( 图 3 )。

图 1 在高通量筛选环境中测试球体的工作。 [ 单个球体可以在96 孔或 384 孔的平板上生长，用化合物处理，然后用混合染料染色，这种染料可以不用水洗就可以成像。如果需要，也可以固定球体。( 右 ) 使用 ImageXpress 显微共聚焦系统上的延时成像功能在 63 小时内拍摄了 HCT116 细胞的透射光图像，以显示球体 (10 倍物镜 ) 的形成。]

图 2 在 z 平面上获得了一组共聚焦图像，其跨度约为球体深度的一半( 左 )。 在任何一层 Z 轴图像上，只有球体的部分细胞是聚焦的，因此为了便于分析，图像被堆叠成一个二维图像，以合并聚焦区域 ( 右 )。

图 3 ( 上图 ) 用宽场系统拍摄的 15 幅 HCT116 球体图像的Z佳聚焦投影。 软件分割计算出 817 个核。由于球体边缘的未聚焦荧光和中心的弱细胞导致畸变，细胞核丢失。( 下图 ) 用共聚焦系统拍摄的 HCT116 球体的 15 幅图像的Z佳聚焦投影。更精确的数字是 1078 个核。
细胞凋亡法筛选anticancer药物
有一类anticancer药物以外源性凋亡途径为靶点，引发细胞死亡。为了证明细胞凋亡检测的有效性，HCT116 球体在 96 孔板中培养 3 天，用 4 种不同anticancer化合物的梯度稀释溶液处理24-48 小时。在化合物处理结果后，用 Life 公司的 CellEvent Caspase 和 MitoTracker 橙色试剂染色来检测细胞凋亡情况。染色过程是将所有染料混合在一起，以 4-6 倍浓度的条件直接加入到每孔中进行染色，其中包含 Hoechst 核染色试剂。染料无需洗涤过程，以避免对细胞球的位置和完整度的影响 ( 图 4 )。

图 4 ( 上图 ) HCT116 球体图像批量成像每孔的缩略图，在 96 孔板上用化合物处理，用 10 倍物镜成像。 Hoechst 染色的细胞核 ( 蓝色 ) 上覆有细胞事件 caspase3/7 凋亡标记物 ( 绿色 )。未经处理的对照样本在第 4 列中。在第 5-7 列中，caspase3/7 信号明显，其中紫杉醇从 a 行的 1µM 连续按照 1:3 的稀释比例进行稀释 ( 重复 3 次 )。( 左 ) 将 11 个 z 平面组合成二维Z大投影图像，并用一个简单的定制模块进行分析。原始图像显示低和高程度的凋亡及其相应的分割掩模 ( royal blue = 细胞核，粉红色 = 凋亡细胞 )。( 右图 ) 通过将凋亡量与未经处理的球体相比标准化并绘制在图表上，可以看出紫杉醇 ( 绿线 ) 诱导凋亡的浓度远低于丝裂霉素 C 或足叶乙甙。

图 5 抗霉素 A 对线粒体的毒性作用。 ( 左 ) Hoechst ( 蓝色 ) 和 MitoTracker ( 橙色 ) 图像的叠加，图中球体经抗霉素 A 处理，浓度依次递增为 1、22、67 和 200 nM。( 右图 ) 球体内线粒体的平均强度值显示了药物的作用。
线粒体膜电位的多重筛选分析
在上面的细胞凋亡筛选中，线粒体膜电位也可以做为筛选条件进行多参数的评估。通过向染料混合物中添加MitoTracker
橙色，即可对球体进行线粒体膜电位进行评估。另外，通过影响线粒体代谢来抑制肿瘤生长的药物也可以使用该方法来进行研究。下面展示了一种对抗霉素 A 的筛选方法。抗霉素A 是线粒体膜电位的potent干扰剂。经过 4 小时的药物处理后，根据球体细胞内的橙色的强度，可以检测到线粒体的健康状况。如图 5 所示，MitoTracker 球体内部的线粒体信号很弱，要么没有完全穿透到大球体的中心，要么中心的细胞没有健康的线粒体。

微板中三维球体的快速筛选
三维细胞球的培养能够产生大小一致的人癌细胞球体，并且能够使用自动化的高通量、高内涵成像技术筛选药物处理后
的球体反应，这是筛选化疗药物候选物相关测试的重要一步。ImageXpress 共聚焦系统和 MetaXpress 软件允许快速成像和分析微板中的 3D 球体，以监测anticancer药物诱导的凋亡和线粒体毒性，来进行候选药物的筛选。有关优化这些球体筛选分析的采集参数的更多信息，请参阅论文：Sirenko, O. et al.,High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development Technologies, 2015。