一种快速、高通量的病毒中和抗体检测方法

简介
新冠病毒的出现导致了世界范围内的新冠大流行，为了理解病毒的发病机理并开发疫苗，亟需快速开发多种研究工具。检测病毒感染和疫苗接种后的免疫反应对新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗体是免疫反应和疫苗效价的关键生物标志物，患者血清样本中的中和性抗体水平是用于监测有效性的重要参数。
人体血清中和抗体的鉴定常使用传统方法例如蚀斑减少中和试验 (PRNT) 来检测。然而，该方法使用活的、具备感染性的病毒加入到靶细胞中，所以需要生物安全三级实验室以及耗时费力的细胞培养。数据结果的分析耗费时间并且不能自动化。此外，假病毒中和试验 (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二级实验室完成，但此方法需要细胞培养和荧光成像来测得中和抗体活性，因此，也不适用于样品的高通量筛选。
此 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒采用免病毒中和测试法 (sVNT) 来克服传统的病毒中和实验的缺点。它采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 的模式，如图 1 和图 2 所示。

优势
• 快速、简单的 ELISA 实验流程设置
• 无需三级实验室或细胞培养
• 实验结果与蚀斑减少中和试验数据一致

刺突蛋白受体结合区域的 HRP 偶联片段与含有中和性抗体的患者血清样本相结合。此混合物加入到已被 ACE2 受体包被的 ELISA 孔板中。如果样品中的抗体有中和抗体的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的结合将被打破，随后清 洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板读板机测量产生的信号，在中和抗体存在的情况下，此信号会更低，将此信号与实验对照组的信号进行比较，可以评估待测样本中存在的中和抗体活性。

刺突蛋白受体结合区域的 HRP 偶联片段与含有中和性抗体的患者血清样本相结合。此混合物加入到已被 ACE2 受体包被的 ELISA 孔板中。如果样品中的抗体有中和抗体的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 结合将会被打破，随后清 洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板读板机测量产生的信号，在中和抗体存在的情况下，此信号会更低，将此信号与实验对照组的信号进行比较，可以评估待测样本中存在的中和抗体活性。

图 2 新冠病毒 sVNT 检测方法。 此实验使用 ELISA 模式，在待测样本中通过中和性的抗体能够检测 RBD 与 ACE2 结合的扰动。

材料
• GenScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒 (GenScript cat. #L00847-A)，
• 10 份血清样本，已经通过 PRNT (Corgenix) 方法证实中和抗体阳性，
• 3 份血清样本，已经通过 PRNT (Corgenix) 方法证实中和抗体阴性，
• MultiWash+ 微孔板洗板机 (Molecular Devices)
• 光吸收检测模式用到的 Molecular Devices 酶标仪：
• SpectraMax ABS Plus 酶标仪
• SpectraMax iD5 多功能酶标仪
• SpectraMax i3x 多功能酶标仪
• SpectraMax M5e 多功能酶标仪
方法
在实验开始前，试剂盒的所有组分和待测样本可放置于室温。试剂盒中的试剂需要按如下操作稀释：
• 用去离子水稀释 20x 储液得到 1x wash，
• 用 HRP 稀释缓冲液按 1:1000 比例稀释 HRP-RBD 储液得到HRP-RBD 工作液。
待测样本 和实验对照组分别与 HRP 偶联的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待测样本、阳性对照、阴性对照，分别用样品稀释缓冲液按 1:10 比例稀释，例如：12uL 待测样品 + 108uL缓冲液。将稀释后的样品和对照组分别与等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的试管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +120uL 稀释后的待测样品或对照品。此混合物在 37 度孵育15 分钟。分别添加 100uL 的阳性对照混合物、阴性对照混合物、待测样品混合物至实验复孔中。然后封盖，在 37 度孵育 15 分钟。使用 MultiWash+ 洗板机和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板，每次每孔 300 uL，横向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每个孔中，封盖，避光，室温孵育 15 分钟。与 TMB 底物孵育后，50 uL 终止溶液加入到每个孔中，立即在多款酶标仪上测读，光吸收波长设置为 450 nm。实验结果的有效性评估看阴性对照的 OD450 值是否大于 1.0，阳性对照的值是否小于 0.3。如果不符合这些标准，实验结果无效，需要重复试验。
各个待测样本的百分比抑制值按如下公式计算：

表 1 的卡值被用来说明样本的结果是阳性还是阴性，是否存在可检测到的新冠中和抗体。表中的卡值来源于新冠 sVNT试剂盒手册。对于不同地区和种族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清样本设置卡值。

结果
使用阳性和阴性对照评估实验结果的质量。如表 2 所示，阴性对照的 OD450 值大于 1.0，阳性对照的 OD450 值小于 0.3，这是根据 sVNT 试剂盒的质量控制要求而定。

表 2，阴性对照的 OD450 值大于 1.0，阳性对照的 OD450 值小于 0.3，验证了实验结果。 对照组做一次重复实验，变异系数 CV 值小于 30% 是可重现的。
如方法中所描述，待测样本和阴性对照的 OD450 值用于计算百分比抑制值。基于试剂盒手册中一般的卡值特点，百分比抑制值大于等于 30% 说明检测到新冠中和抗体，呈阳性；百分比抑制值小于 30% 说明未检测到新冠中和抗体，呈阴性。在PRNT 中和活性检测中呈阴性的三个样品，在 sVNT 检测中也呈阴性。同样地，在 PRNT 中和活性检测中呈阳性的十个样品，在 sVNT 检测中也呈阳性 ( 如表 3)。

表 3 先前测得的多个样品的百分比抑制值和阳性、阴性结果。 使用SpectraMax ABS Plus 获得表中所示的实验结果，其他类型的酶标仪也获得相同的结果。
结论
此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒数据来源于一组患者血清样本，与传统的、耗时费力的 PRNT 方法获得的数据吻合。此 sVNT 试剂盒提供了易于使用的试剂和紧凑的 ELISA 工作流程，大约 1 小时能够完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板机完成，节约了宝贵的时间。SpectraMax 读板机和 SoftMax Pro 软件产生的数据能够运用实验特异的方案进行分析，设置公式可以应用于所需的计算和自动结果输出。