定量检测血清样本中 SARS-CoV-2 Spike ( 刺突蛋白 ) 和 Nucleocapsid ( 核衣壳蛋 白 ) 的 IgG 抗体

简介
快速、准确和常用的分子水平检测技术对于应对 SARS-CoV-2(COVID-19) 的大流行发挥着重要作用。为了加深我们对感染和免疫之间关系的理解，检测感染和检测抗体都尤为重要。重要的挑战是要探索出能够满足这些检测需求的灵敏、一致的和易用的检测方法，并且这些检测方法的成本是在合理范围内。目前市面上针对感染Z准确的检测方法是针对病 毒mRNA 的定量 RT-PCR，然而，它并不能够反映出免疫反应的过程。鉴于目前重点仍然是放在开发更有效的方法以识别病症，而在抗体检测的分析方法的开发层面的进展仍然不足。目前市场上的抗体测试有很多假阳性结果，因此他们都不是了解SARS-CoV-21 免疫反应细微差别的可靠方法 1。因此，对于研究 COVID-19 免疫和抗体应答来说，一种可靠的、高通量的方法亟需开发。
Enzo 开发了一种更先进的基于酶联免疫吸附实验 (ELISA) 方法，针对性的优化了检测人血清和血浆样本中抗 SARS-CoV-2核衣壳蛋白的 IgG 抗体 (ENZ-KIT193)。SARS-CoV-2 核衣壳IgG 是人类对 SARS-CoV-2 病毒核衣壳蛋白的适应性免疫反应所产生的抗体。核衣壳蛋白在 RNA 包裹和病毒颗粒释放中起重要作用，核衣壳蛋白抗体的存在表明Z近或之前有过感染。核衣壳蛋白高度保守，不易随时间发生突变，是长期研究 COVID-19 免疫的Z佳靶标 2。此外，Enzo 还开发了一种附加的 ELISA 试剂盒——SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG 的 ELISA试剂盒 (RUO) (ENZ-KIT190)，能够检测 人血清中抗 SARSCoV-2 刺突蛋白的特异性抗体。SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG是人类对 SARS-CoV-2 病毒刺突蛋白的适应性免疫反应产生的一种抗体。刺突蛋白对于病毒与人类细胞表面的 ACE2 受体结合并进入细胞进行复制是必不可少的，因此它成为了目前一些疫苗研究理想的靶标。Enzo’s SARS-CoV-2 核衣壳IgG ELISA 试 剂盒 和 SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG ELISA 试 剂盒是目前和未来研究来确定对 COVID-19 感染的抗体应答和免疫以及疫苗研究的关键工具。
优势
• 对核衣壳蛋白和刺突蛋白 IgG 抗体的特异性 >95%
• 每试剂盒可检测 86 个样品，采用高通量定性免疫分析
• 获得优越的检测间 / 内精度的比色读数

两种 ELISA 试剂盒组合能够拓展检测范围，提高灵敏度，特异性达到 95%，针对其目标分析物， 核衣壳 IgG 抗体和刺突蛋白 IgG 抗体，分别在 30 分钟或 2 小时内可测多达 86 个样本。因此，这套试剂盒组合超过了我们对准确性和速度的要求，并有着推进研究进展的潜力。对 SARS-CoV-2 感染后抗体行为的深入了解，将有助于研究人员揭示感染后 SARSCoV-2 免疫应答的特征，也可助于理解这种高传染性病毒免疫的基本问题。
材料
• SARS-CoV-2 刺 突 蛋 白 IgG ELISA 试 剂 盒 (RUO) (Enzo cat.#ENZ-KIT190-0001)
• SARS-CoV-2 核 衣 壳 IgG ELISA 试 剂 盒 (RUO) (Enzo cat.#ENZ-KIT193-0001)
• COVID-19 阳性人血清 (BioIVT cat. #HMSRM-COVIDIGG):
• Lot#HMN368394-SR1
• Lot #HMN368436-SR1
• Lot#HMN368437-SR1

• Lot#HMN373782-SR1
• Lot#HMN373791-SR1
• Lot #HMN374206-SR1
• 去掉凝块的人血清 ( 阴性 ) (Amsbio cat. #HSER-2mL):
• Lot #122019A
• SpectraMax ABS Plus 酶标仪
方法
实验设置
使用前先将两个试剂盒中的材料放置于室温中，包括每个试剂盒中进行检测对照和重复血清样本的足够的酶标条，将 20x的洗涤液稀释至 1x。从 SARS-CoV-2 检测呈阳性的患者或大流行前收集的正常血清中分别提取血清样本，用每种试剂盒的产品手册中的样品稀释液稀释制备。
Elisa 试剂盒的操作步骤见表 1

SARS-CoV-2 核衣壳 IgG ELISA 结果计算
Z终的 OD 值由所有孔的检测 OD 值减去空白孔的平均 OD 值计算获得，包括标准品和血清样本。
Z终的 OD = 样品孔 OD - 空白孔平均 OD
使用 SoftMax®Pro 软件拟合的 4 参数 logistic 曲线绘制了每个标准品的平均 OD 值与其浓度的关系 ( 图 2 )。然后通过校正曲线外插半定量计算结果。当内插浓度≤ 2000ng/mL 时，表 示不 存 在 SARS-CoV-2 IgG；>2000ng /mL 提 示存在 SARS-CoV-2 IgG。

SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG ELISA 结果计算
Z终的 OD 值由所有孔的 OD 值 减去空白孔的平均 OD 值计算，包括阴性对照、低阳性对照、高阳性对照和血清样本 :
Z终的 OD = 样品 OD - 平均空白 OD

计算每个样本的指标值

产品手册中给出了 0.08 的 cut-off 值并用于计算结果。指标值 ≥ 1 表示结果为阳性，指标值为 < 1 表示阴性结果。所有计算都在 SoftMax Pro 软件中建立分组表，读取 ELISA 板时自动计算结果。
结果
对于这两种 ELSA 试剂盒，COVID-19 阳性患者的血清样本均呈阳性，这意味着所有这些样本都含有核衣壳蛋白 IgG 和刺突蛋白 IgG。正常血清样本两种检测均为阴性。SoftMax Pro软件根据数据自动计算出的结果分组表见表 2 ( 核衣壳蛋白IgG ELISA 试剂盒 ) 和表 3 ( 刺突蛋白 IgG ELISA 试剂盒 )。

结论
总之，这些数据表明——Enzo 试剂盒，针对 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白 IgG 的 ELISA Kit (RUO) (ENZ-KIT193) 和 SARSCoV-2 刺突蛋白 IgG 的 ELISA Kit (RUO) (ENZ-KIT190)，是一种准确度及通量高的检测方法，可以同时快速检测人类样本核衣壳蛋白 IgG 抗体和刺突蛋白 IgG 抗体的解决方案。
此外，这 2 个试剂盒 在 SpectraMax ABS Plus 上运行方便，并用 SoftMax Pro 软件生成一致和高效的结果。
这些定量和半定量数据为单个患者样本的特异性 IgG 分析提供了有价值的指标，也为人群监测研究提供了准确的数据。因此，他们为在临床中实施这些解决方案提供了新的机会，以便进一步调查了解 SARS-CoV-2 感染和免疫应答人群研究中的免疫原性反应、免疫持续时间和模式的细微差别。这两个试剂盒的应用可以在预防和管理未来的大流行病方面发挥重要作用。