如何在 SpectraMax iD5 和 i3x 微孔读板 机上优化 Transcreener TR-FRET 检测

介绍
Transcreener HTS 是一种通用的，高通量的生化测定平台，该测定法是基于核苷酸 (ADP) 的检测，核苷酸可由数千种激酶催化形成，其中很多激酶的催化共价调节反应对细胞的信号传导至关重要，并作为靶标在药物发现中具有重要价值。

TranscreenerTR-FRET 测定法是一步竞争 性免疫测定法，可直接检测带有远红荧光标记的核苷酸的荧光信号。该测定
法是基于时间分辨荧光的共振能量转移 (TR-FRET) 的原理。该测定体系中使用的是与高特异性单克隆抗体 - 淬灭剂偶合
物结合的远红示踪剂，在紫外范围 ( 约 330 nm ) 激发铽 (Tb)配合物会导致其能量转移到示 踪剂，并在更高的波长 (665
nm) 产生发射光。目标酶产生的二磷酸或单磷酸核苷酸置换了与抗体链接的示踪剂，导致 TR-FRET 降低 ( 图 1)。使用
红色示踪剂可Z大程度地减少荧光化合物和光散射的干扰。Transcreener TR-FRET 测定法是专为 HTS 设计的，采用一
步添加，混合和读取的测定模式。

优势
• 一步添加，混合即读取的测定形式，非常适用于高通量筛选
• 使用远红示踪剂和时间分辨荧光技术，将荧光化合物的干扰降至Z小
• 使用 10 μM ATP 在 10% 的转化率下达到出色的数据质量 Z′＞ 0.7

验证要求
实现 Transcreener HTS 分析优势的一个关键因素是获取数据的酶标仪的正确设置，是否正确选择仪器设置 ( 包括滤光片和其他组件 ) 可能会影响仪器对任何给定测定的灵敏度。通过运行 10 μM ATP/ADP 标准曲线 (24 次重复 ) 来确定
Transcreener HTS 检测性能的关键仪器参数，并使用该标准曲线模拟酶促反应。从 10μM 浓度的 ATP 开始， ADP 的量慢慢增加，ATP 的量则按比例的减少，使腺嘌呤核苷酸总浓度保持在 10 μM。调整闪光次数来实现 Z′ ＞ 0.5 的质量要求。如果 ATP 在 10% 的转化率下能达到 Z′ 值＞ 0.7，则表明该仪器能够用于 Transcreener TR-FRET 检测。

材料
• Transcreener ADP2 TR-FRET Red Assay (cat. #3011-1K)
• ATP/ADP 组合液 : 10 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 0.01%Brij-35 and ATP/ADP ( 结合成恒定的腺嘌呤浓度 10 μM )
• ADP 检测混合液 : 1X Stop and Detect Buffer C, 8 nM ADP2Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer
• High FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ATP
• Low FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ADP
标准曲线制备
1. 在 384 孔 板的整 行中分配 10 μL 的每种 ATP/ADP 组合浓度的组合液。
2. 在这些行中加入 10 μL ADP 检测混合液。
3. 将 10 μL 的 10 μM ATP/0 μM ADP 组合液分配到 P 行。

4. 将 10 μL 的 High FRET 混合液分配到 P1-P12 孔中。
5. 将 10 μL 的 Low FRET 混合液分配到孔 P13-P24 中。
有关制备标准曲线的详细步骤，请参阅相应的 Transcreener技术手册 (https://www.bellbrooklabs.com/technicalresources/technical-manuals/)。
微孔板读板机
• SpectraMaxiD5 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #ID5-STD)，配备以下组件：
• TRF 增强模块 (Molecular Devices cat.#0200-7030)
• 滤光片 320/100 ( 可由 Molecular Devices 提供 )
• 滤光片 616/10 (Molecular Devices cat. #6590-0118)
• 滤光片 665/10 (Molecular Devices cat. #6590-012)
• SpectraMax i3x 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #I3x)，配备以下组件：
• HTRF 检测卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)

仪器设置
SpectraMax iD5 和 SpectraMax i3x 读板机结合 SoftMax Pro数据采集和分析软件， 使用优化的设置继续执行以下步骤：
1. 打 开 SoftMax Pro 软件，“ 读数模式“ 选择 TR-FRET，”读数类型“ 选择 Endpoint； 在 SpectraMax i3x 读板 机上，光学配置选择 HTRF ( 卡盒 )。
2. 在 SpectraMax iD5 读板机上，安装 320/100 激发滤光片以及 616/10 和 665/10 发射滤光片，然后从激发和发射下
拉波长菜单中选择这些滤光片。在 SpectraMax i3x 读板机上，安装 HTRF 卡盒，当选择 HTRF 作为光学配置时，波长
将自动选择。

3. 根据要检测的微孔板选择微孔板的“ 类型 ”，待测的微孔板区域选择“ 读数区域 ”。
4. PMT 和选项设置：将每次读取闪烁 ( 或每次读取脉冲 ) 设置为 20 到 100 ( 本文应用程序中设置为 50 )，测量延迟设
置为 0.05 ms，积分时间设置为 0.7 ms。
5. 针对每批新的微孔板或所使用的测定体积，zui好优化微孔板位置和读板的高度。只要体积，微孔板批次，示踪剂和浓度保持不变，相同的仪器设置可用于后续板的读取。 表 1 总结了上述设置。

结论
在本文中，我们验证了使用 SpectraMax i3x 和 iD5 多功能读板机进行 Transcreener ADP2 TR-FRET 测定过程中表现出的优越性能，通过使用优化设置，可以达到 Z′ 值 > 0.8 ( 表 2 )。对于这两种仪器，在 2％ 或更高的 ATP 转化率下都达到了高于验证标准 0.7的 Z′ 值 ( 图 2 )，超过了在 10％ ATP 转化下 Z′ 大于 0.7 的Z低验证要求。