应用｜使用Gilson pipetmax 从全血中全自动分离血浆的经济型应用

2024-03-15610

WHOLE BLOOD

引言

血浆是血液的主要组成部分，约占总血量的55%。它是一种透明的淡黄色液体，携带有血小板、红细胞和白细胞。从红细胞中分离出来的血浆，可由实验室进行许多的临床检测。这些检测包括监测治疗药物、检测艾滋病毒、肝炎、类固醇分析及各种其他常见的临床检测。为了将血浆从全血样品中分离出来，首先要将样品离心，使红细胞沉淀至试管底部(图1)。然后，可以通过移液的方式将顶层的血浆转移。

图1 全血离心后的典型组成

本应用描述了使用Gilson 桌面型液样工作站PIPETMAX? 从全血样品中转移血浆的过程。

PIPETMAX可吸取精确体积的血浆，并将其转移到合适的分析或储存管。如特定的实验流程需要，也可以添加稀释液到分析管中作为方法的一部分，并将血浆与稀释液混合。

PART 1

材料与方法

血浆分离步骤是在Gilson桌面型液样工作站PIPETMAX?上进行的。PIPETMAX采用空气排代式移液技术，与传统的手动移液器类似。这使得其表现和结果与现有的实验室标准相似，同时消除了一些在移液过程中可能发生的人为错误。而这些错误可能是由于不良实验习惯、缺乏培训或者由于大量重复劳动而引起的疲劳等原因引起的。

PIPETMAX

在本应用中使用了标准带盖保护罩的PIPETMAX（图2），装配单个移液头及一个用于96孔板的标准托盘。使用TRILUTION? micro v3.0 软件运行方法程序。

图2 Gilson桌面型液样工作站PIPETMAX?

移液头

本应用使用了一个4x1200的移液头。较大容量的吸嘴可以更有效地将稀释液分配至目标管中，同时也能够将样品管中的血浆准确地按所需的体积转移。

4×1200移液头使用Gilson PIPETMAN? DIAMOND D1200吸嘴（如有需要，也可以使用DF1200ST 无菌过滤吸嘴）。在该配置中，吸嘴的间距为18 毫米，非常适合用于血浆检测的典型样品管。例如，典型的真空采血管外径为16毫米。

8 道移液头吸嘴的间距为9毫米，过于窄小，因此上述配置相比使用8道移液头更为高效。

由于本应用不需要第二个移液头，因此PIPETMAX移液头支架的左侧安装了一个“空白”头。

托盘和管架

本应用使用了PIPETMAX标准托盘（托盘布局参见图3），该托盘比适用于384孔板的托盘更为经济。PIPETMAX 托盘有九个SBS标准板位，其中一个位置专用于废弃吸嘴盒的放置；另一个位置放置了D1200吸嘴，即一盒96个吸嘴；第三个位置，放置了一个含稀释液的6道储液槽；Z后六个位置由样品管和目标管占用（各占三个板位）。

图3 Gilson桌面型液样工作站PIPETMAX?

为适应所需的特殊工作流程，我们设计了两种定制管架。一种定制管架用于放置采血管(BD Microtainer? MAP microtubes)，单个管架可容纳24支采血管。第二种定制管架用于放置目标管(screw cap cryovials)，单个管架也可容纳24支采血管。样品管和目标管比例为1:1，可确保两者无误差排布。

托盘上剩下的六个位置，可以用于样品管架和目标管架的放置，每种各三个。在PIPETMAX上，这相当于完整的两行，因此我们将三个样品管管架放置在托盘的中间行，三个目标管管架放置在托盘的Z外面一行。由于每个管架可容纳24支管，这意味着每次运行可处理总共72个样品。

软件

PIPETMAX 使用Gilson TRILUTION micro v3.0 进行控制，运行的程序是使用Gilson Protocol Builder v2.1 编写。

为了使移液参数的优化尽可能简便，运行程序在编写时即引入了多个变量。在TRILUTION micro软件运行时就可以调整这些变量的设置，而无需每次都编写新的程序。这有助于程序的快速优化，允许用户在实验室中“动态”调整参数，无需编程操作。

图4展示了在程序编写过程中设置的变量，该程序包括稀释和混合步骤，以及从样品管中转移上层血浆的步骤。在这里我们可以看到，吸液、排液和排空的流速可以进行调整，样品数也可以进行调整。在混合步骤中，混合次数和混合时吸取的体积也可以作为变量进行调整。

图4 变量的优化

移液程序

使用 PIPETMAX，可以运行多种程序，这些程序可以包括完整的工作流程，也可以将工作流程中的一部分保存为单独的程序进行使用。本篇应用中的完整移液程序，第一步是从储液槽中吸取1260μL的稀释液，并转移到指定的冻存管中。这一步使用了Protocol Builder软件中的“Transfer”，“Deliver from Pool”移液命令。在这一步骤中，参数设置了使用同一吸嘴吸取和转移液体，直到该步结束时更换吸嘴。尽管操作体积超过了该移液头/吸嘴组合的Z大容量， PIPETMAX 会自动将该体积均分，分两步完成了操作。

在将稀释液转移至冻存管内后，第二个步骤是从每个样品中移取 140μL 上清液至冻存管内。这个步骤也是一个移液命令，但用了“stamp transfer”命令，并设置了参数，强制 PIPETMAX在样品之间更换吸嘴，以避免样品之间的交叉污染。在移液命令设置的Z后，选择了“mix”选项, PIPETMAX 完成样品转移步骤后，将立即使用相同的吸嘴将样品稀释液混合。除了将样品和稀释液混合之外，这一步还确保了在样品排出后，吸嘴上残留的任何液滴都被冲洗出来并进入冻存管中，从而提高了移液的精准性。

图5 移液程序

样品的选择

从血液样品中移取血浆的困难之一是样品不一致。血液样品的成分会因不同个体而有差异。如果患者贫血，那么红细胞的含量相对于样品体积就会更低。其他基于患者的差异可能来自患者的健康状况，如水合水平、健康状况、性别、年龄、Z近摄入的药物或酒精，以及接触的毒素或病毒。

除了样品组成的可变性外，实验室收到的样品体积也可能存在差异。在采集血液样品时，通常使用真空管（vacutainer tube），该过程涉及使用真空将血液从体内抽入接收管中。真空抽吸获得的样品体积通常会存在一定差异。因此，在样品组成的可变性之外，还可能存在一定程度的体积差异。

这种可变性可能导致一些样品不适合由 PIPETMAX 进行自动血浆采样。作为一种经济的解决方案，PIPETMAX 通过程序设定从样品管中定义的高度开始吸取血浆。这意味着所有样品管中至少需要有X体积的总样品，以便在编程高度有血浆可以吸取到PIPETMAX的吸嘴中。一旦抽吸开始，PIPETMAX会通过软件标准自带算法控制，使吸嘴跟随液位下降。在这种情况下，X的数值将根据收到的样品按照实验室的需要来确定。

需要考虑差异性的另一部分是在吸取所需体积时，起始点和红细胞层之间是否有足够的血浆。可以通过基于红细胞需要低于一个可定义为Y的体积来更好地考虑这一点。

图6 样品接收标准

总的来说，如果红细胞的体积小于体积 Y，且总样品体积大于体积 X，则该样品适合使用 PIPETMAX进行移液（见图6）。由于血液样品是放置在相同的采血管中的，因此可以合理地根据管内的高度估算这些体积，而无需测量体积。可以通过眼睛估算管内的高度，仅需配合定制管架来辅助就能可视化判断。

为了Z佳优化工作流程，离心分离红细胞和血浆后，在取出样品管时应当进行适当样品的筛选。任何被认为不适合的样品都需要单独考虑。有些样品可能红细胞含量较高，总体积较低，这可能导致样品中没有足够的血浆来获得所需的体积。在这种情况下，没有任何移液方法能解决问题，必须使用较小的样品体积进行工作，或者提出需要更多的样品；有些样品管则可能含有过多的样品，导致血浆充足但红细胞体积过大，超出可接受范围。这些可以筛选出来并手动处理，或者如果这类样品足够多，可以在PIPETMAX 上运行另一个使用不同吸取起始位置的替代程序。

移液操作优化

为了获得Z佳移液效果，调整了PIPETMAX移液参数。移液的关键参数如下：

液面跟随（Liquid Level Following）

需要使用 PIPETMAX 的这一功能。如果没有使用液面跟随功能，那么整个吸取过程中吸嘴的位置必须设定得更低，而这更可能导致吸入红细胞。

吸液流速（Aspiration Flow Rate）

移液的吸液流速设置为所使用的4×1200 移液头的Z低流速。这使得可以在不干扰红细胞层的情况下吸取血浆。优化中没有对该参数进行充分的研究，可能更快的吸液流速也是适用的，但在这个吸液流速下，总处理时间已经足够短，可以接受。

排液流速（Dispense Flow Rate）

排液流速设置为 10 mL/min，这样可以很好地从移液吸嘴中排出血浆，同时不会出现因为使用过快流速而产生的飞溅现象。

排空流速（Purge Flow Rate）

排空流速也设置为10 mL/min，排空时吸嘴位置设置在目标管的顶部，并偏移至接收管的侧面与内壁接触。贴边排液可以把移液的重现性Z大化。在仅需转移样品的方法中，此排空步骤直接在样品转移后进行；在其他包含分配稀释液和混合的方法中，排空步骤则在混合完成后进行。混合是使用转移样品的同一吸嘴完成的。

混合次数（Number of Mixes）

PIPETMAX 的混合过程包括从管底吸取，然后从上方排出。这种低吸取高排出的过程允许液体以Z佳方式移动，确保充分混合。我们发现进行三次混合已经足够。根据所使用的稀释剂和相对于样品的稀释剂体积，混合次数可能需要适当调整。

混合体积（Mixing Volume）

自动液样处理的混合体积通常应该是待混合体积的3 / 4左右。这足以保证良好的混合，而不会发生吸入空气和产生不想要的气泡的风险。在本应用中，Z终管中的总体积为1.4 mL，因此混合体积约为1mL；正如预期的那样，效果很好。

更换吸嘴（Tip Changes）

每个血液样品都是来自不同患者的样品，因此必须始终使用新的吸嘴进行移液，以避免样品的交叉污染。为了进一步确保零污染，可以使用PIPETMAX搭配过滤吸嘴，进一步提升吸嘴的屏障。在处理样品之前，对冻存管进行稀释剂的分配是批量完成的，因此整组四个吸嘴可以用于整个稀释液的分配。

平衡时间（Equilibration Time）

在整个程序中，平衡时间都设置为1秒。这可以帮助任何移液动作之后，液体进行“沉降”，然后PIPETMAX移液头才移动到下一个位置。

PART 2

结果和结论

当需要为特定实验或项目处理大量血液样品时，手动处理的工作量是一项艰巨的任务。在本研究中，已经证明PIPETMAX可以完成这些工作量，从而腾出实验室工作人员的时间用于其他工作。

PIPETMAX 的4通道移液头非常适合这种管对管的工作。通过20、200和1200 μL量程的4通道移液头1，PIPETMAX 可以处理本应用中的大范围体积需求。许多其他自动移液处理设备只有1或8通道的能力，限制它们一次只能使用一个通道进行处理，而PIPETMAX可以同时使用所有四个通道，这使得处理速度比其他情况下快4倍。

4x1200头能够准确移液低至 60 μL 的体积，这意味着在这个程序中只需使用一个移液头，从而降低了成本规格，使得购买PIPETMAX对于大多数有此需求的实验室来说具有成本效益。

在程序开始运行时，批量分配稀释液到所有管中，可以Z小化吸头的使用量，并且不需要使用“导电”、“特殊”或“自动化专用”吸头，这导致了设备在年复一年中的整体运行成本大大降低，并提升系统可靠性。完成72个样品的稀释液分配和带混合的样品转移的整个批量处理过程中，总共只使用了76个吸头。