【qPCR仪常见的问题处理】有问题不逃避，有解决才进步！
2024-05-29472qPCR仪常见的问题处理
在做实时荧光定量PCR仪实验的时候，经常看到一些很奇怪的扩增曲线图。扩增曲线图的特点可以为我们排查这些问题提供重要的线索。首先我们要了解正常实时荧光定量PCR仪扩增曲线的特征，然后重点分析解决一些常见的问题。
标准实时荧光定量PCR仪的扩增曲线有三个不同的阶段：基线期、指数期、平台期，这些现象表明仪器扩增正常没有问题。如果扩增曲线特别异常，不平滑、乱线、均一性差以及异常扩增等这些问题出现，那么我们要进行这些异常曲线原因进行排除这些问题。
实时荧光定量PCR仪是基于靶DNA复制样品积累足够荧光以超过阈值的循环数而显示的。而且阈值可以进行手动选择，也可以自动选择，使其明显高于荧光本底信号并低于平台期。通常，在较好实验中所有样品的位置将阈值调整到相应的中点。理想情况下，这是在不同扩增曲线的循环差异保持不变的范围内。
异常扩增曲线图故障排除
以下是异常扩增曲线存在问题的一些示例，以及潜在原因和纠正方法。
无模板控制 （NTC） 组中有曲线呈指数扩增
原因：
（1）实验室暴露时间长于造成的污染；
（2）试剂生产过程中遗留的污染。
● 解决办法：
（1）用醋氯酸或75%酒精清洁工作区域；
（2）在洁净的生物安全柜中制备反应混合物，与任何模板源分开；
（3）重新订购新的试剂储备；
（4）使用有污染模板时，确保试剂保证无污染。
在早期周期中循环数据点，
记录数据开始时的高噪点
原因：
（1）基线调整开始较高；
（2）反应中添加了高浓度模板。
● 解决办法：
（1）查看原始数据，在基线校正之前观察扩增图。注意线性 面的起点和终点。在观察到指数增加之前，在平坦基线开始和结束两个周期后，将基线重置 ；
（2）将输入样品稀释至反应的线性范围内。
异常形状的曲线 以及Ct值滞后
原因：
（1）PCR反应效率低；
（2）引物Tms的差异大，产生不等的延伸；
（3）退火温度过低；
（4）DNA的突变；
（5）模板材料含有抑制剂。
● 解决办法：
（1）优化引物浓度和退火温度；
（2）将引物重新设计到靶序列的不同区域；
（3）退火温度调整；
（4）将引物重新设计；
（5）根据仔细量化的对照测试测定性能。
标准曲线斜率大于或小于-3.34，
R2值小于0.98
原因：
（1）稀释度不准确；
（2）标准曲线超出检测的线性范围；
（3）标准曲线极值处的数据是可变的。
● 解决办法：
（1）使用分光光度计重新计算标准浓度或基因拷贝数；
（2）制作新的质控标准液；
（3） 去除极端浓度；
（4） 重新稀释标准品浓度。
平台期低目标预期
原因：
（1）试剂量不够；
（2）试剂（dNTP 或预混液）降解；
（3）一些探针染料不足；
（4）反应效率低下；
（5）探针浓度不正确。
● 解决办法：
（1）检查预混液的计算比例和数量；
（2）使用新鲜储备溶液重复实验；
（3）使用用相同染料标记的探针将终点荧光与不同的反应进行比较。
非预期的数据
原因：
（1）样品标记不正确；
（2）模版加液不准确；
（3）引物特异性差；
（4）样品中的抑制剂多。
● 解决办法：
（1）重新运行样品或孔板时要格外小心；
（2）重新设计引物以提高特异性；
（3）对样品进行稀释（抑制剂将被稀释，并可能导致稀释材料的 Cq 降低）。
Cq 比预期的要早得多
原因：
（1）RNA的基因组DNA污染；
（2） 样本浓度高低不同差异大；
（3）引物产量高；
（4）引物特异性差；
（5）转录本在目标样品中天然具有高表达。
● 解决办法：
（1）逆转录前的DNA处理；
（2）重新设计引物，确保特异性；
（3）优化引物浓度和退火温度；
（4）根据仔细量化的对照测试测定性能。
整个放大图中的锯齿状信号
原因：
（1）放大不良或探针信号弱；
（2）机械误差；
（3） 核苷酸不稳定等。
● 解决办法：
（1）确保使用足够数量的探针，以免放大背景；
（2）尝试一批新的探针；
（3）在反应设置过程中充分混合引物/探针/主溶液；
（4）联系设备技术员。
技术重复是可变的，
并且在 0.5 个循环> Ct 值存在差异
原因：
（1）移液误差；
（2）溶液混合不充分；
（3）靶转录本表达低导致随机扩增；
（4）反应优化不佳；
（5）模板不均匀。
● 解决办法：
（1）校准移液器；
（2）使用外置活塞式移液器和过滤吸头；
（3）在制备过程中彻底混合所有溶液；
（4）吸液时垂直握住移液器（无菌技术不能确保小体积时的可重复性）；
（5）优化反应条件；
（6）如果可能，添加更多样品以降低 Cq。
样品之间不可重复的比较
原因：
（1）一个或两个样品的扩增效率低于8；
（2）效率差异为大；
（3）RNA降解；
（4）稀释度不准确。
● 解决办法：
（1）重新设计一个或两个基因的引物；
（2）用新鲜试剂和样品重复实验；
（3）检查靶标表达度较高的样品。
所选孔中没有数据
原因：
（1）未选择孔进行分析；
（2）分析染料选择错误；
（3）PCR失败；
（4）无目标转录本的表达。
● 解决办法：
（1）检查数据收集和数据查看的设置；
（2）确定是否可以看到背景荧光；
（3）使用新试剂重复实验；
（4）根据仔细量化的对照测试测定性能；
（5） 检查样品。
最高浓度重叠
原因：
超出检测范围限值。
● 解决办法：
（1）检查样品浓度；
（2）检查荧光幅度浓度。
基线漂移
原因：
（1）探针降解；
（2）孔中有气泡 解决办法；
（3）检查基线而不减去基线；
（4）检查每个孔中所有染料的行为（气泡影响所有染料）。
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