假阳性的预防及处理，每一位PCR实验人员都绕不开的必修课

PCR技术因其快速、灵敏、特异等特性广泛应用于分子生物学的研究与检测中，但却对实验环境及操作有着严格的要求，稍有不当则会导致假阳性产生。污染严重时甚至可以持续数月，很难在短时间内控制。换引物、换试剂、换耗材、换实验楼，甚至有人跑到两公里外的实验室加样也无济于事，如何避免及处理假阳性问题已经成为每一位PCR实验人员的必修课。

01 什么是PCR假阳性

假阳性结果示例1（Q1600荧光检测）

PCR假阳性包括两种，即检测阴性材料得到阳性结果，检测空白对照（加入去离子水）出现阳性结果，实验中设立的阴性对照可以提示有无假阳性结果出现。

假阳性结果示例2（Repure-A电泳检测）

02 PCR假阳性的原因有哪些

PCR扩增产物污染是导致假阳性的重要因素，因其拷贝量大，微量的污染源即可导致阳性结果，其中以气溶胶污染Z为常见。其次，PCR试剂及样本的交叉污染也会导致假阳性。PCR试剂的污染包括加样枪、容器、双蒸水及其它溶液的核酸污染，样本污染主要是取样工具之间的交叉污染或加样污染。

此外，在实验室操作中经常会用到阳性参考品，参考品大多数由某些克隆质粒制作而成，克隆质粒使用不当也会造成污染。

03 假阳性的预防及解决措施

①规范实验室设计：实验室包括配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区，在连续独立的空间完成不同实验操作。若没有专业的实验室，至少需要保证配液、加样与检测在不同的区域；

②规范实验室操作：实验室定期通风与消毒，仪器定期清洁，并使用气溶胶清除剂。使用一次性用具，小心操作，避免交叉污染；

③规范试剂耗材管理：新买试剂需进行实验前验证并进行分装，所用耗材需高压消毒；

④实验前预防：首先需保证所设计引物的特异性，防止引物自扩增，其次还可使用UNG酶及dUTP防污染体系；

⑤污染后处理：如遇污染应立即停止实验，采取开窗通风，紫外灯照射，喷雾装置喷洒等操作，此后若连续三天阴性对照正常即可恢复正常实验。

04 二维梯度PCR可有效避免多次PCR带来的假阳性风险

DY轮PCR的污染基本可以避免，PCR实验越频繁，则越容易污染，能一次做50个，不要分开5次每次做10个。而对于科研实验而言，使用二维梯度PCR可以一次得到96个温度组合，而不需要分开8次，每次做12个梯度，在节省人力物力的同时也大大降低了假阳性的风险。

RePure-D 二维复合梯度基因扩增仪

 RePure-C  二维梯度基因扩增仪

“上YZ未病”，对于PCR的初学者而言，做实验之前首先需要树立“预防”的观念，严格把控样本处理、核酸提取、扩增及检测的每一过程。同时，在实际操作中也需要注意规范实验步骤，避免因加样失误而导致的交叉污染，从源头杜绝假阳性现象。