生物合成过程的时间分离是发芽酵母细胞周期中代谢振荡的原因

提升实验效率，加速科学发现

许多控制真核细胞分裂基本过程的细胞生物学和生化机制已被确定，然而，在细胞分裂周期中生物合成过程的时间动态仍然是难以捉摸的。本文表明，关键的生物合成过程在细胞周期中是时间分离的。使用发芽酵母作为模型和单细胞方法动态测量代谢活性，我们观察到蛋白质合成的两个峰值，在G1和S/G2/M阶段，而脂质和多糖的合成只在S/G2/M阶段出现一次峰值。将推断的生物合成速率整合到热力学-化学计量代谢模型中，我们发现生物合成过程中的时间分离导致初级代谢通量的变化，在G1阶段葡萄糖摄取通量的加速以及氧气和二氧化碳交换的相移振荡。通过对模型预测的实验验证，我们证明了初级代谢随着细胞周期周期性振荡，以满足在细胞周期中表现出意想不到的动态变化的生物合成过程的需求。

细胞生长和分裂是基本的生物学过程。虽然我们对控制细胞分裂周期的细胞生物学和生化机制有很扎实的认识，但我们对在细胞周期中驱动细胞生长的生物合成和初级代谢的时间动态知之甚少。虽然已知DNA生物合成在S期内受到时间限制，但其他主要生物合成过程，如蛋白质和脂质合成的动态仍然不清楚；生物合成过程是否在整个细胞周期中持续活跃？如果它们的活性发生变化，不同生物合成过程的速率是否以同样的方式发生变化？这些知识对于揭示细胞生长调节背后的机制至关重要，其缺陷与疾病有关。

目前，蛋白质合成被认为在整个酵母细胞周期中以指数或恒定速率增加，这是由使用放射性标记和单细胞分析的群体水平研究确定的。然而，最近我们发现，由内源性TEF1启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)的生产速率在G1期达到峰值，这表明蛋白质生物合成活性在细胞周期中实际上可能是非单调的。这一发现与G1期核糖体蛋白质丰度的峰值相一致，尽管其他人没有发现这种动态。同样，与核糖体生物发生和翻译相关的基因的表达也被观察到在G1期达到峰值；然而，单细胞RNA测序(RNA-seq)研究报告了G1期核糖体蛋白质mRNA的少量增加或细胞周期中没有显著差异。对于其他大分子类别，如脂类和核酸，根据最近的多组学研究，它们的生物合成也被认为在细胞周期的某些阶段加速。然而，这些研究中测得的分子丰度仅为实际生物合成速率提供了间接证据。因此，细胞周期中生物合成活动的时间动态仍然很大程度上难以捉摸。回答这个问题可能需要以动态的、细胞周期分辨率的方式测量速率，这迄今为止带来了巨大的技术挑战。

以芽生酵母为模型，采用动态单细胞荧光显微镜和一种新的“停止-反应”方法，我们发现蛋白质、脂质和多糖生物合成的活性在细胞周期中既不是指数也不是恒定。具体而言，我们发现蛋白质生物合成在每个细胞周期中表现出两波活性，而脂质和多糖生物合成的活性在蛋白质生物合成的第一波G1中较低，但在S/G2/M的第二波中较高。我们通过细胞质量动力学的数学模型将发现的生物合成活性模式转换为绝对单位，并将它们集成到热力学-化学计量代谢模型中，从而推断出初级代谢通量的细胞周期动力学。由于我们可以实验验证推断的代谢通量变化，这为发现的生物合成活性的动态模式提供了额外的证据，也使我们能够得出结论，生物合成过程中的时间分离必须负责初级代谢的小时尺度振荡。我们的研究表明，细胞周期中的细胞生长是暂时分离的生物合成和初级代谢过程的集合，这为细胞生理学的基本原理提供了基本的见解。

大分子生物合成是暂时隔离的
 为了确定细胞周期中蛋白质生物合成的活性，我们从一个异源的，因此不受调控的启动子(tetO7)表达了超叠层GFP(sfGFP)，这样sfGFP的产生完全依赖于蛋白质生物合成机制的活性。我们记录了在微流控装置中生长的单个细胞中sfGFP荧光强度和细胞体积随时间的变化，并通过一个数学模型推导了sfGFP的产生速率，假设sfGFP成熟的一阶动力学。为了定义细胞周期阶段，我们使用mCherry标记的Whi5的核进入来表示有丝分裂出口(G1的开始)，随后Whi5重新定位到细胞质来表示START，就像之前所做的16,17。我们使用芽出现的时刻来标记S期的开始。

在微流体实验中使用培养基之前，我们通过在30 °C下摇瓶至少30分钟来过滤和预热培养基。在微流体装置中，细胞通过注射泵或空气加压泵系统(OB1,Eveflow)在流量传感器(MFS2,Eveflow)的辅助下不断提供新鲜培养基。在组装向微流体装置提供培养基的系统时，我们采取了必要的预防措施，以避免污染培养基(即，在本生灯或层流柜附近工作，用乙醇消毒管材并用压缩清洁空气干燥)。在微流体装置中培养期间，借助显微镜培养箱(Life Imaging Services)，温度保持在30 °C。通过提供新鲜培养基控制时间，细胞在微流体装置中保持恒定条件。描述单个实验的方法提供了关于培养基及其碳源补充的详细信息，摇瓶中的培养方案，微流体装置中的培养基流速和这些实验中使用的培养基/氧含量开关。

利用动态扰动实验和新的微观单细胞分析，我们揭示了生物合成过程的活动是如何在出芽酵母细胞周期中及时组织的。我们发现蛋白质生物合成活动在每个细胞周期中有两个波，一个在G1，另一个在S/G2/M，而脂质和多糖生物合成的活动只在S/G2/M同步达到峰值。通过将生成的动态生物合成数据集成到数学模型中，我们确定了初级代谢的代谢通量的变化，这些变化是用来满足随时间变化的生物合成活动。我们可以实验验证推断的代谢通量，并发现了NAD(P)H动力学中生物合成过程的时间分离的额外证据。这表明，在细胞周期中初级代谢的代谢通量变化是为了满足新发现的随时间分离的生物合成活动的前体和能量需求。因此，我们揭示了细胞周期中细胞内生理学的关键时间方面。

蛋白质生物合成活动的未发现的两波行为与目前在细胞周期中单调动力学的概念相反。这一概念来自早期使用放射性标记的研究。事实上，对关键参考工作的数学分析表明，其基于放射性双标记和离心淘洗的方法无法区分蛋白质合成速率的指数动力学和周期动力学。最近的单细胞显微镜和荧光蛋白研究也表明，蛋白质合成速率是单调的。在这里，有趣的是，虽然以前工作的作者声称蛋白质生物合成速率在细胞周期中是恒定的，但人们可以清楚地从他们的数据中看到，在出芽前后荧光蛋白生产速率的可重复下降，这是导致我们推断蛋白质合成速率的非单调行为的一个方面。最后，根据Manalis实验室的一项研究，使用悬浮微通道谐振器来确定酵母细胞生长速率作为细胞质量的函数，也可以得出结论，蛋白质合成速率在细胞周期中是恒定的。然而，必须注意的是，作者在相当广泛的细胞浮质(>3倍变化)和相应的细胞生长速率(>11倍变化)范围内进行了线性回归，这些范围比细胞周期中的范围更大(根据我们的数据估计，干质量约为1.4倍变化，干质量导数约为1.6倍变化)。因此，我们在这里报告的细胞周期中蛋白质合成速率的变化可能很好地隐藏在其他工作细胞质量/生长速率数据的噪声中。此外，细胞周期中的细胞组成变化可能会混淆浮质数据与我们与干质量相关数据的直接比较。本文作者谨慎地没有对酵母细胞生长速率的细胞周期动力学得出任何结论。

我们发现脂质和细胞壁多糖生物合成活性在细胞周期中发生变化。具体来说，乙酰辅酶A羧化酶Acc1(脂肪酸生物合成的关键酶)的温度敏感突变体细胞在限制性温度下被阻滞在G2/M期61。此外，编码成脂酶(Acc1、Fas1和Fas2)的信使RNA的翻译效率以及参与鞘脂生物合成的脂肪酸延长酶Elo2的转录在G2/M期被发现增加。最近的两项研究表明，脂质代谢途径中涉及的一系列代谢物在S/G2/M期达到峰值9。对于多糖，一项基于脉冲标记电子显微镜实验的早期研究报告称，在酿酒酵母中，葡聚糖和甘露聚糖的生物合成速率在出芽后(S/G2/M)增加，并在胞质分裂和出芽前阶段(G1)下降。

我们可能应该开始以不同的方式看待“细胞生长”的概念。虽然众所周知，细胞生长速率(以细胞质量或大小为标准)在细胞周期中变化，但我们在这里展示了细胞生长和质量的个体贡献者(合成不同细胞组分的生物合成过程)在细胞周期的不同时刻具有不同的活性。我们早些时候已经在G1中展示了这一点，其中蛋白质生物合成速率高，细胞大小增长低8，但现在我们将其扩展到整个细胞周期和其他生物合成过程。虽然几十年来一直从整体上看待细胞生长的概念，扩大了对细胞大小和细胞周期控制的知识，但我们现在建议进一步以更具差异化的方式看待细胞周期中的细胞生长，其中蛋白质、脂质和多糖的生物合成作为细胞生长的关键贡献者，在时间上是部分隔离的。

我们的工作表明，生物合成过程中未发现的时间隔离是细胞周期中观察到的代谢动力学的原因，其中G1阶段出现高葡萄糖摄取和发酵通量，随后在S期开始时切换到呼吸作用，并最终向有丝分裂出口返回高发酵。初级碳和能量代谢中的这些动力学似乎可以满足生物合成过程中随时间变化的需求。一项基于葡萄糖限制的同步培养和最近的α因子同步细胞的多组学研究已经产生了这些方面的重要迹象，但我们现在(基于直接活性测量)可以为这一概念提供实际证据。此外，我们观察到在广泛的实验条件下，无论细胞何时分裂，都会出现代谢振荡，这表明代谢振荡并不出现在特定的初级代谢途径中，如早期推测的呼吸或存储相关途径。因此，初级代谢可能是动态的，因为它必须满足对前体、氧化还原和能量辅助因子临时变化的需求，以供应不同的生物合成过程。

现在关键的问题是什么导致了生物合成中的时间分离。首先，人们会推测它是由细胞周期机制驱动的，这确实在代谢中有目标；然而，我们和其他人最近发现，在几个小时范围内的代谢振荡，表现为NAD(P)H,ATP或黄素动力学，也发生在没有经历细胞周期的细胞中，包括经历Cdc20或α-因子处理的动态耗竭的细胞。这表明生物合成/代谢振荡(至少不是主要)由细胞周期活动产生。我们猜测不同的生物合成过程之间的负反馈相互作用可以形成一个生物合成振荡器。这种负反馈可能是基于初级代谢资源的竞争，或者是基于基因表达的调节，例如，通过代谢物依赖的染色质修饰。或者，生物合成动力学可以由早期提出的转录振荡器、信号通路(例如TORC1/2、PKA和Snf1)感知生物量前体水平或由一个覆盖这些不同参与者的机制来协调。

图1：蛋白质生物合成在细胞周期中有两个活动波。
a,b,异源启动子(tetO7)表达的sfGFP生产率，从动态单细胞荧光和体积测量计算，包括sfGFP成熟(扩展数据图1a-d)。sfGFP生产率的细胞周期迹线(线连接标志)由具有径向基函数(RBF)核的高斯过程回归模型的后验均值(粗实线曲线)和高后验概率区域(阴影区域，平均±s.d.)总结(a)。AU，任意单位；b/w，之间。虚线和虚线粗曲线表示通过相同的数据分析管道在两个额外的重复实验中获得的后验均值(所示为分析的细胞周期的数量和平均持续时间)。为了对齐细胞周期迹线并计算细胞周期阶段，我们使用有丝分裂出口(ME)、START、出芽(BUD)和下一个ME作为参考点，其在三个重复中的平均时间被标示。单独给出了细胞周期中的sfGFP生产率(b)。a中第一个重复的细胞周期迹线被插值，在17个均匀间隔的相点取样，并对min-max归一化。c,通过测定单细胞NAD(P)H对CYH的响应，用停机-反应法测定蛋白质生物合成活性，这是在CYH添加时NAD(P)H衍生物与未干扰条件下相同阶段中位NAD(P)H衍生物之间的差异。在CYH实验中，这个差异乘以?1，因此代谢反应平均为非负值。标记表示原始母细胞NAD(P)H荧光；曲线表示平滑(Savitzky-Golay滤波器)。d，细胞周期中对CYH的NAD(P)H响应有两个峰。标记表示从一个重复实验中分析的单细胞，如c。实线和阴影区域表示通过RBF核概括标记值的高斯过程回归的后验均值和高后验概率区域(均值±s.d.)。虚线表示在第二个重复实验(所示的分析细胞数量)中通过相同的数据分析管道获得的后验均值。垂直线表示两个重复实验中ME、START和BUD的平均相位。预期ME的相位是添加CYH之前的平均细胞周期持续时间。我们分析了在干扰之前至少产生了两个芽的细胞(不是新生细胞)。

图2：脂质和多糖生物合成的活性在细胞周期中发生变化，在S/G2/M期达到峰值。
a,NAD(P)H对CER的响应在细胞周期中发生变化，表明脂质生物合成活性在S/G2/M期达到峰值。该图类似于图1d。实线和阴影区域代表高斯过程回归的后验均值和高后验概率区域(均值±s.d.)，该回归利用RBF核总结了标记的值。虚线曲线是通过相同的数据分析管道从重复实验中获得的后验均值，为了简单起见，我们在这里没有显示单细胞值，但表明了分析的细胞数量。b，细胞表面积的导数在细胞周期中发生变化，类似于a中的脂质生物合成活性。该图类似于图1a，总结了25个细胞周期轨迹。导数是在光滑的单细胞轨迹中计算的，细胞质裂解相关的不连续性通过邻近细胞周期数据的y轴几何平移得到解决。c，在细胞周期中，对生长素诱导的Ugp1耗尽的NAD(P)H响应变化，表明细胞壁多糖生物合成活性在S/G2/M期达到峰值。合成生长素1-萘乙酸(NAA)被用来诱导Ugp1耗尽。该图类似于a和图1d。在缺少degron标签的对照菌株中，对NAA的NAD(P)H响应在细胞周期中基本保持不变(扩展数据图3)。

图3：基于模型分析推断的生物合成速率的细胞周期动态。
 a，数学模型描述了细胞周期中细胞质量发展的动态。该模型(1)结合了单细胞测量，如蛋白质、脂质和多糖生物合成的活性、细胞体积、母细胞体积和表面相对于整个细胞的分数、细胞周期事件的时间；(2)纳入了文献中关于细胞密度动态和细胞周期平均细胞质量组成的知识；(3)推断了以绝对单位(pg min?1)表示的五个主要生物量组分的生物合成速率。为了实现这一推断，我们最小化了细胞质量估计之间的距离，这是已发现的生物合成模式(图1d和2a,c)的函数，以及通过乘以我们的动态细胞体积测量(扩展数据图4)和相应细胞周期阶段的细胞密度测量33得到的经验细胞质量。对于蛋白质、脂质和多糖，我们展示了两个重复实验(左)中测量的生物合成活性的平均±s.d.。数据来自一个实验，显示为平均±s.d.。(右：体积)。模型方程见补充方法。b，以绝对单位(pg min?1)表示的五大生物量组分的推断生物合成速率。c，推断的细胞周期中总生物量生产速率rbiomass(t)，通过求和b中蛋白质、RNA、脂质、多糖和DNA生物合成速率计算得出。d，推断的生物合成过程对整个细胞周期总生物量生产的相对贡献。为了计算相对贡献，我们将b中单个生物合成速率除以c中细胞周期每个阶段的总生物量合成速率rbiomass(t)。对于a中细胞质量估计和b-d中所有变量的数据表示，误差带显示了八个模型优化中推断变量的最小-最大范围，覆盖了蛋白质、脂质和多糖生物合成的重复测量的所有组合(a，左)作为输入；粗线表示了模型优化中的推断变量，该模型优化使用输入数据集，其中每个大分子生物合成的两个重复测量均为平均值。

图4：通过生物合成速率预测的初级代谢的动态表型与实验观察一致。
 a，在指数增长培养物中，细胞外交换代谢物的产量与葡萄糖一致，细胞周期平均通量预测与独立测量结果一致(x轴，平均±s.d.来自其他地方89;y轴数据见下文)。b，初级碳和能量代谢中预测通量的细胞周期动态。c，细胞周期中细胞质ATP的周转预测以及该代谢物最大生产者或消费者反应中的ATP通量。周转量计算为该代谢物生产反应中的ATP通量总和。我们展示了至少在一个细胞周期阶段中细胞质ATP通量大于0.09或小于-0.09 mol cell?1 h?1的反应。PGK，磷酸甘油酸激酶；PPCK，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶；ADP/ATP，腺嘌呤核苷酸转运体(氧化磷酸化)；PFK，磷酸果糖激酶；HEX，己糖激酶。d，从中心碳和能量代谢转移到主要生物质组分合成的生物质前体的预测通量。NA，核酸；PS，多糖；e4p，红糖4-磷酸；pep，磷酸烯醇丙酮酸；pyr，丙酮酸；g6p，葡萄糖6-磷酸；f6p，果糖6-磷酸；accoa，乙酰辅酶A;glyc3p，甘油3-磷酸；r5p，核糖5-磷酸。垂直线表示主要细胞周期事件的典型细胞周期阶段(b-d)。对于a-d的数据(y轴)：a中标记显示的预测，b和c中线连接的较大标记，c中的热图和d中的线对应于提供大分子生物合成平均重复测量的细胞质量模型的输出(图3b-d实线)；a中y轴误差条(最小-最大范围)和b和c中较小标记显示的预测对应于使用8种不同重复测量组合的细胞质量模型的输出(图3b-d阴影区域)。e，在细胞周期中葡萄糖类似物2-NBDG脉冲变化后获得的细胞内荧光。实线和阴影区域表示高斯过程回归通过RBF核总结单细胞值(标记)的后验均值和高后验概率区域(均值±s.d.)。虚线曲线：重复实验中通过相同的数据分析管道获得的后验均值(所示的分析细胞数量)。f，在表达糖酵解通量生物传感器的细胞中，在细胞周期中，具有和缺乏糖酵解通量调节的YFP和mCherry的生产率分别是解耦的。在单个细胞周期轨迹中，解耦是作为YFP和mCherry瞬时生产率之间的差异来计算的，以使其具有相同的标度。解耦值越高，就反映了相对于mCherry生产率而言，YFP的生产率越高，因此糖酵解通量值越高。曲线和阴影区域显示中位数及其95% CI。为了对齐单个细胞周期轨迹并计算阶段，我们使用细胞质分裂(CYT,0)、出芽和下一次细胞质分裂(CYT,1)作为参考点。

参考文献：
Takhaveev, V., ?zsezen, S., Smith, E.N. et al. Temporal segregation of biosynthetic processes is responsible for metabolic oscillations during the budding yeast cell cycle. Nat Metab 5, 294–313 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00741-x

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