物理免疫逃逸：减弱的机械通讯导致转移性结直肠癌细胞从巨噬细胞中逃逸

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肿瘤免疫微环境中的生物化学信号对癌症转移具有重要意义，但微环境中物理因素的作用仍未得到深入探讨。本文探讨了癌细胞与免疫细胞之间通过细胞外基质（ECM）介导的机械相互作用如何影响癌细胞的免疫逃逸。我们着重分析了巨噬细胞在两种不同转移潜能结直肠癌（CRC）细胞上的靶向能力受到机械调节的情况。结果显示，由于低转移潜能CRC细胞在ECM上表现出强大收缩力，巨噬细胞可以有效地靶向这类癌细胞；而高转移潜能癌细胞在ECM上表现出较弱收缩力，从而可躲避巨噬细胞攻击以实现免疫逃逸。我们关于免疫和癌症之间复杂机械相互作用的发现将为进一步探索癌症免疫治疗策略提供重要参考。

癌症转移是一个复杂而艰巨的挑战，它取决于癌细胞逃避免疫细胞攻击、突破细胞外基质（ECM）并迁移到其他部位形成次生肿瘤的能力。尽管人们已经充分认识到肿瘤免疫微环境对癌细胞免疫逃逸和转移的影响，但目前的研究主要集中在生物化学信号上，对微环境中的物理因素作用的探讨相对较少。特别是，我们还不清楚由ECM介导的癌细胞与免疫细胞之间机械相互作用如何影响癌细胞的免疫逃逸。

微环境中的机械信号对于调节生物过程至关重要，并且最近在免疫活动中引起了人们的兴趣。在免疫细胞中，巨噬细胞扮演着主要的防御屏障角色，能够动态迁移以消除外来物质和异常细胞，例如癌细胞。值得注意的是，杨等人发现了一种引人入胜的物理机制，补充了传统的趋化作用，在这种机制中巨噬细胞通过ECM传输的非牵引信号来靶向乳腺癌细胞。这种机制涉及到机械敏感离子通道蛋白、Ca2+和细胞骨架蛋白。然而，巨噬细胞对具有不同转移潜能的癌细胞的机械响应性以及这种机械响应性与癌细胞逃避巨噬细胞免疫攻击策略之间的关系尚不清楚。

为了填补这些知识空白，我们构建了一个体外准三维共培养系统，其中使用I型胶原水凝胶作为ECM来模拟体内微环境，并研究了两种不同转移潜能的结直肠癌（CRC）细胞（SW480和SW620）对巨噬细胞的响应。为了评估这些响应，我们采用粒子图像测速（PIV）来测量由癌细胞牵引引起的ECM变形，并利用微操作器控制的微型毛细管来模拟两种不同类型癌细胞对ECM施加的牵引力。我们的研究结果表明，CRC细胞的牵引力可以极大地影响巨噬细胞的靶向效率，而机械通讯减弱使得具有更高转移潜能的CRC细胞能够逃避巨噬细胞，从而实现增强的免疫逃逸。

SW480和SW620细胞分别来源于同一患者不同结直肠癌阶段，具有明显的肿瘤发生特性。其中，SW480源自原发肿瘤，而SW620则来自第二次腹腔镜手术时淋巴结转移。我们旨在从机械生物学角度探究细胞外基质对这两种类型细胞免疫逃逸的影响。

为了模拟体内微环境，构建了体外准三维共培养模型，该模型整合胶原凝胶提供机械支持和信号。SW480或SW620细胞与巨噬细胞(pma处理的U937)在2 mg/mL胶原凝胶上共培养，细胞比例为1:25(图1A)。如图1B所示，在SW480与巨噬细胞共培养系统中，巨噬细胞可以远程精确靶向癌细胞SW480，形成黏附细胞聚集;附着的巨噬细胞比例(随时间)明显增加，表明巨噬细胞可以持续靶向SW480细胞(图1C)。相比之下，巨噬细胞与SW620细胞共培养，明显不表现出示踪能力;大多数巨噬细胞保持静止状态(图1 B和C)。这一观察结果表明，与SW480细胞相比，共培养系统中的SW620细胞有更大的机会逃避巨噬细胞，从而实现免疫逃逸。

图1：(A) CRC细胞与巨噬细胞体外准三维共培养系统示意图。(B)在2mg /mL胶原凝胶底物上共培养的CRC细胞(绿色)和巨噬细胞(红色)延时图像。(C)以单个癌细胞为中心的200 μm × 200 μm范围内，巨噬细胞粘附在胶原(COL)底物和固体培养皿(PD)底物上的比例。所示为平均值±SEM。(D)癌细胞(绿色)和周围的胶原基质(白色)。箭头表示SW480细胞重建的胶原纤维束。(比例尺为50 μm) (E)癌细胞诱导位移场的代表性幅度图。颜色条表示位移值。白点表示癌细胞的位置。(比例尺为100 μm) (F)局部ECM位移与SW480细胞的距离。(G)以SW480为中心的200 μm × 200 μm区域内ECM在1、3、6和12 h后的最大位移(n = 51)。(H) 1、3、6和12 H后SW480细胞(n = 51)和SW620细胞(n = 54)的有效变形半径。(I)分别在2 mg/mL和4 mg/mL胶原底物上粘附SW480细胞的巨噬细胞比例(n = 38)。

作为对照试验，癌细胞和巨噬细胞也在固体培养皿中共培养(不含ECM)，结果显示巨噬细胞对SW620或SW480的靶向率均小于5%，表明ECM在诱导上述免疫逃逸中起着关键作用(图1C)。此外，将ECM的刚度从大约25 Pa增加到100 Pa (SI Appendix)也会导致在24小时内吸引到SW480细胞的巨噬细胞减少(图1I)。那么，一个自然要问的问题是，ECM的什么特性导致了这种逃逸，特别是，这种逃逸是否与ECM介导的癌细胞和巨噬细胞之间的机械通讯有关。为了回答这个问题，我们将研究分为两部分:我们首先研究这两种类型的癌细胞如何分别使ECM变形并改变其微观结构，然后研究巨噬细胞如何对给定的ECM变形作出反应，这些变形是由外部施加应力引入的，用于模拟两种类型的癌细胞造成的变形。

图2：(A)分别在- 10 mbar和- 800 mbar压力下微血管诱导的位移场的震级图。标尺尺寸为100 μm。(B)细胞迁移角θ和方向性比d/ d的定义。(C)吸引类、定向类和非定向类巨噬细胞的比例。(D)?800 mbar(红色)和?10 mbar(蓝色)组中不同机械反应的巨噬细胞的方向性比D /D和(E)迁移速度。(F) E-cadherin (CDH1)和α -整合素(ITGA1) mRNA在NC组(阴性对照，重组siRNA处理)和siEcad组(靶向E-cadherin的siRNA)中的相对表达量。NC组(n = 44)和siEcad组(n = 46)作用于2 mg/mL胶原凝胶底物12 H后SW480细胞的(G)和(H)。(I) NC组和siEcad组12 h后巨噬细胞对SW480细胞的吸引百分率。

Video1：巨噬细胞和SW480细胞的准三维共培养系统。巨噬细胞可以从远处精确靶向SW480细胞(绿色)，并在6小时内形成粘附细胞聚集。时间间隔为1小时。

Video2：巨噬细胞和SW620细胞的准三维共培养系统。大多数巨噬细胞在12小时内保持静止状态。每一帧上都标注了时间点。

总之，SW480和SW620细胞引起的ECM变形的不同以及不同ECM变形对由外力引起的巨噬细胞响应的不同，共同表明：通过ECM传递的张力信号在决定巨噬细胞的靶向效率和癌细胞的免疫逃避能力方面发挥着重要作用：低转移潜能的癌细胞（SW480细胞）会引起较大的ECM重建和变形，使巨噬细胞能够感知它们发出的机械信号并向它们移动，而高度转移的癌细胞（SW620）则由于对ECM的机械收缩减弱而能够逃避巨噬细胞。为了进一步验证不同转移能力的细胞的ECM介导的力在免疫逃避中的作用，我们通过使用小干扰RNA（siRNA）降低SW480细胞的E-cadherin表达来增强其转移能力（如图2F）。针对E-cadherin的siRNA SW480 (siEcad-SW480)表现出较弱的粘附ECM的能力（图2G和H），因为siEcad-SW480细胞中与细胞-胶原粘附相关的整合素α1β1的表达相应降低（图2F），在相应的共培养系统中，巨噬细胞的靶向效率也降低（图2I）。这些结果证实，具有更高转移能力的癌细胞产生的力量较弱，相应地对巨噬细胞的吸引力也较弱。我们的发现可以为巨噬细胞对抗癌细胞的免疫反应提供有价值的见解，并为未来的癌症免疫疗法策略提供重要的参考。

参考文献：

Physical immune escape: Weakened mechanical communication leads to escape of metastatic colorectal carcinoma cells from macrophages.

Chen Yang 1 2, Xinrui Dong 2 3, Bingrui Sun 2 3, Ting Cao 4, Ruipei Xie 2, Yiyu Zhang 2, Ziyue Yang 2 3, Jing Huang 5, Ying Lu 2, Ming Li 2, Xiaochen Wang 2 6, Ye Xu 1, Fangfu Ye 2 6, Qihui Fan 2

1 北京航空航天大学机械工程与自动化学院，北京100191
2 中国科学院物理研究所北京凝聚态物理国家实验室，北京100190
3 中国科学院大学物理科学学院，北京100049
4 浙江大学医学院第一附属医院，杭州310003
5 北京大学基础医学院免疫学系，北京100191
6 中国科学院大学温州研究所瓯江实验室(浙江省再生医学与视觉与脑健康实验室)，浙江温州325000

Edited by David Weitz, Harvard University, Cambridge, MA; received December 23, 2023; accepted April 29, 2024
Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 May 28;121(22):e2322479121.
https://doi.org/10.1073/pnas.2322479121

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