基于微技术方法的类器官模型（2020年10月）

2024-08-0646

可靠创新同行发展

生物材料和干细胞技术的创新使得新的三维(3D)类组织结构(类器官和类球体，Organoids and Spheroids)得以出现。因此，与传统的2D细胞培养和动物模型相比，这些复杂的3D结构提高了准确性，并促进了人类疾病、人类发育和个性化医疗的体外研究。由于这一领域的快速发展，许多球体和类器官的生产方法已经发表。然而，目前许多球体和类器官的生产技术受到复杂性、产量和可重复性的限制。微制造和微尺度平台(如微流体和微印刷)有望解决目前类器官和球体生成中的一些限制。微制造和微流体装置已被证明可以改善营养物质的输送和交换，并允许排列生产尺寸控制的培养区域，以更低的成本产生更均匀的类器官和球体，从而获得更高的吞吐量。在这篇综述中，我们讨论了最新的生产方法，目前面临的挑战，类器官和类器官的生产，以及微制造和微流体的应用，以改善类球体和类器官的生产。具体来说，我们专注于微制造方法和设备，如光刻，微接触印刷和微流体输送系统如何推进类器官和球体在医学中的应用。

长期以来，动物模型和传统的二维(2D)细胞培养模型一直被用于了解人体生理和病理。虽然这些模型已经传播了许多科学进步，但它们在模拟人类生理和病理方面的应用是有限的。由于人类和动物之间存在的生理差异，动物模型在模仿人类特异性生物学方面存在固有的局限性。虽然人类细胞的单层培养可以成为了解人类特异性生物学的窗口，但二维细胞培养的简单性并不能反映体内组织的复杂性和细胞多样性。此外，出于伦理考虑，我们获得成人或人类胚胎组织的机会很少。这些限制导致了材料和制造技术与干细胞技术相结合的进步，产生了被称为类器官和球状体的3D人体组织模型。类器官是三维细胞培养模型，可以自我组织成复杂的类器官组织。类球体/球体是可用于多细胞肿瘤建模的3D培养系统;更广泛地说，球体可以被定义为在非贴壁基质上培养的细胞聚集体。因此，它们已经成为研究人类发育、疾病进展和治疗以及开发动物模型无法实现的个性化医学方法的开创性系统。通常，球状体是由癌细胞系或从肿瘤组织中分离出来的细胞团在非粘附底物中形成的(图1a)。尽管类器官模型可以从含有上皮细胞的碎组织中生成，但大量的类器官模型方案使用干细胞作为类器官生成的细胞来源(图1b)。干细胞是一种特殊类型的细胞，其特点是具有自我更新的能力以及产生更多特化细胞类型的潜力。引人注目的是，干细胞可以产生分化的后代，这些后代可以自我组织成再现器官形态和功能的组织。细胞通过自分泌和旁分泌信号以及暴露于特定的细胞外基质(ECM)来实现这一目标。虽然最近已经引入了几种球体和类器官的生产技术，但在生产过程中仍存在一些挑战需要克服(表1)。特别是类器官的可重复性生产仍然具有挑战性，因为它们的生产是一个复杂的多步骤过程，取决于多种变量，如细胞类型、细胞状态和生长。球体的生产受到尺寸不均匀的阻碍。例如，由旋转烧瓶生成的球体尺寸范围为65至300μm。微制造和微尺度平台(例如，微流体和微印刷)已经显示出解决当前类器官和球体一代的一些限制的希望。在这篇综述中，我们将讨论干细胞类型，用于生成人类类器官和球体模型的传统技术及其缺点。我们的主要重点是强调最先进的基于微技术的类器官和类球体生产平台，它们在微制造和微流体辅助的类球体和类器官模型中的优势和应用。

图1: 类球体和类器官发育示意图。

从人类癌症组织中，可以分离出肿瘤细胞并置于培养物中以产生球形细胞。b胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)是两种常用的干细胞类型，用作类器官生产的细胞来源。当给予正确的信号提示和ECM时，ESCs和iPSCs都可以形成多种类器官模型

表1 不同类器官和球体制作方法的对比表

球体和类器官生产技术
用于类器官生产的干细胞来源
干细胞可分为三大类:(i)胚胎干细胞(ESCs)， (ii)诱导多能干细胞(iPSCs)和(iii)成体干细胞。人类ESCs可以从不用于生育治疗的备用胚胎中提取。在分离后，人类ESCs几乎可以无限数量地繁殖，同时保持在成人体内产生任何分化细胞类型的潜力，这是一种被称为多能性的显著特性。与ESCs类似，iPSCs是通过细胞重编程将分化的体细胞恢复到胚胎多能性而产生的多能细胞。当给予正确的信号提示时，ESCs和iPSCs都可以被指示从各种组织(如视杯、肝脏和大脑)形成3D类器官。除了具有不受限制的发育潜力外，iPSCs还允许对来自特定个体的体细胞进行细胞重编程，以产生与其基因匹配的个性化类器官模型。这种方法为精准医疗带来了巨大的希望。

与ESCs和iPSCs不同，成体干细胞是多能细胞，可以在体内产生几种特化的细胞类型。组织特异性成体干细胞通过产生组织的特化细胞类型来维持成体组织的稳态是必不可少的。这一特性可用于诱导成体干细胞形成与其原始组织非常相似的三维类器官模型。一个值得注意的例子是单个肠道干细胞，它可以产生与肠上皮结构惊人相似的类器官模型，并且可以在体外无限扩展。类似的成体干细胞衍生的类器官模型已经从其他组织如乳腺、肺和前列腺中产生。干细胞用于类器官生产的选择在很大程度上取决于下游应用、组织可及性和研究人员的专业知识。在接下来的章节中，我们将重点介绍目前的类器官生产方法、它们的缺点以及基于微技术的方法在改善类器官生产中的应用(表1)。

ECM支架法
在类器官生产中最常用的技术之一是由汉斯·Clever的团队开发的。该方法已被用于生成小鼠和人类前列腺类器官、人类卵巢组织以及人和小鼠肝细胞类器官。在这种方法中，提取的成体干细胞被镀在Matrigel(一种常用的ECM蛋白混合物)上，并在培养条件下维持。当需要特定的细胞类型(基底细胞或腔细胞)时，细胞用抗体染色，用荧光激活细胞分选(FACS)系统进行分选，随后在单独的Matrigel培养皿上镀。这种方法产生基因和表型相似的类器官。在这些模型中，利用细胞- ecm相互作用驱动细胞组织的事实。ECM通常用不同的天然或人工水凝胶进行复制，包括基质凝胶、海藻酸盐、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白和聚乙二醇。在这种技术中，ECM试剂可以被镀、交联或与细胞悬浮液混合。这种方法提供了在组织样环境中监测细胞粘附、迁移和趋化性等细胞生物学过程的能力。这种方法的一个缺点是支架的可重复生成，它代表了组织中自然存在的ECM的组成。天然水凝胶的组成与体内ECM更接近;然而，天然水凝胶的生产可重复性不高。因此，每批水凝胶都具有不同的机械性能，这反过来又可以影响和改变类器官的形成。纯化的ECM成分，如胶原蛋白和层粘连蛋白的生产是可再生的，但它们不能代表组织中ECM的复杂性。合成水凝胶允许更明确的机械和生化特性。然而，它们需要添加能够上调细胞过程(如粘附和生长)的试剂。图2a显示了ECM支架方法中涉及的步骤示意图。作为一个例子(图3a, b)，肝癌细胞、人间充质细胞和内皮细胞的混合物在3D肝脏来源的ECM水凝胶(LEMgel)中形成肝脏类器官。为了模拟肝脏的生理ECM，我们将羊肝切片去细胞制备LEMgel。尽管在LEMgel中产生的肝类器官体积很大(直径超过1mm)，但通过活细胞染色测量，该模型中细胞死亡最少。此外，通过定量RT-PCR检测，类器官LEMgel促进成熟肝细胞标志物的表达，使其更接近人肝脏的水平。在另一个例子中，通过液体覆盖法在琼脂糖上培养原发性肺癌细胞。在这项研究中，在形成肺癌3D模型之前，将细胞嵌入胶原蛋白中。这种方法形成了直径在50到200μm之间的类器官。这些模型在测试抗癌药物的功效方面有潜在的用处。

图2: 常规类器官/球体生产方法总结。

用于生成类器官或球体的方法的综合示意图，包括(A)细胞外基质支架，(b)旋转生物反应器，(c)悬挂滴，(d)低贴壁细胞培养板和(e)磁悬浮法。

图3: 细胞外基质支架法生成的肝类器官示例。

这些肝类器官是通过在肝源性3D ECM水凝胶(LEMgel)中播种肝癌细胞、人间充质细胞和内皮细胞获得的。a相衬和(b)荧光图像显示肝类器官内的活细胞(绿色)和死细胞(红色)。c旋转烧瓶法生成肾脏类器官示意图。这个特殊的例子展示了胚胎样体是如何由多能干细胞形成的，并将其放入旋转瓶中产生肾脏类器官。

旋转生物反应器法
悬浮培养是另一种三维(3D)构建方法。悬浮培养利用加入增加悬浮液粘度的药剂或使用搅拌系统。例如，羧甲基纤维素的加入增加了悬浮培养物的粘度。旋转烧瓶或生物反应器用于悬浮培养，利用搅拌来避免细胞附着在培养皿表面。对于旋转烧瓶，细胞被放置在一个通常由搅拌棒不断搅拌的容器中。虽然这种方法允许简单的介质交换，但产生的球体通常很大且尺寸不均匀(范围在65到300 μm之间)。生物反应器由旋转的细胞培养容器代替搅拌棒组成。细胞在生物反应器方法中所经历的剪切力可能会潜在地影响细胞生理。因为生物反应器有不同的尺寸，所以不同尺寸的球体是可能的。然而，它们有一个缺点，即它们在形状上是异质的。虽然旋转烧瓶和生物反应器都会对细胞产生剪切力，但剪切力不像旋转烧瓶中那样显著。图2b描述了使用旋转生物反应器方法开发球体的过程。作为一个例子，图3c显示了如何使用旋转烧瓶批量生成肾脏类器官。这些肾类器官来源于在低附着板中培养的多能干细胞，以形成胚胎体。胚胎体内Wnt信号通路的化学诱导可形成大小不等的肾类器官模型，大小从200 μm到700 μm不等。大于700 μm的类器官模型显示细胞凋亡增加，这表明控制类器官的大小对促进三维培养中的细胞活力至关重要。这种方法的简单性允许可扩展地生产肾脏类器官，模仿体内肾脏的基因表达和细胞生物学特征。大脑组织，被称为脑类器官，也通过旋转生物反应器形成，并将神经外胚层组织嵌入Matrigel液滴中。在这种方法中，胚胎体由在低FGF信号介质中生长的人多能干细胞形成。胚胎体被诱导形成与体内皮层惊人相似的3D神经上皮组织，表达具有相同大脑发育空间格局的不同皮层的标记物。脑类器官中的神经元显示神经元活动，通过钙显像测量。这种方法可以通过从由基因突变引起的小头症患者的多能干细胞中制备脑类器官来模拟小头症。此外，使用旋转壁血管，转化肺细胞(bZR-T33)的球体在几周内形成，显示出与人肺组织相似的免疫染色图谱。旋转生物反应器允许批量生产具有大尺寸范围的球体。

吊滴法（Hanging drop method）
挂滴法是一种气液界面技术(图2c)，它依赖于细胞在液气界面的积累来形成球体。这些细胞最初悬浮在一滴培养基中，并放置在培养皿盖的背面。由于表面张力和重力的作用，液滴被固定在那里。然后将悬浮的细胞和盖子放在含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)的培养皿中，以避免液滴蒸发。悬挂滴板(HDPs)的出现，在盘子中创造了一系列球体，简化了用这种方法生产球体。该平台还与液体处理机器人技术相结合，可以同时制造大量3D结构。对于这种方法，有几个优点，包括简单，一致性，缺乏对基质的要求，能够升级到高通量生产，以及能够从少量细胞中生产球体。悬滴法的一些缺点包括机器人成本高，不能使用大液滴(>50μL)，不能在不影响球体的情况下改变细胞培养基。挂滴法的一个示例如图4a, b所示，其中使用MCF7和MDA-MB-231等乳腺癌细胞系生成乳腺癌球体。两种不同的胶原浓度分别为500和1000μg/mL，用于制备球体。该方法可用于比较球形细胞的侵袭性、它们对抗癌药物的反应和大规模共培养效应，使其成为生成个性化癌症球体模型的可行选择。通过比较二维单层和三维球体抗癌药物的效果，作者发现三维球体对药物治疗更耐药。

图4: 吊滴法的一个示例示意图。在这个版本的挂滴法中，使用基于pdms的挂滴阵列(PDMS-HDA)实现3D球体培养。

a采用PDMS-HDA装置进行三维细胞培养的挂滴步骤。b分别在500 μg/ml(左)和1 mg/ml(右)含胶原的培养基滴剂中形成MCF7和MDA-MB-231细胞的乳腺癌球体模型。标尺:100 μm。经科学报告(Scientific reports)许可转载。c生物3D打印方法示意图。组织球体由生物打印机分配在维管树段中，并允许在组织融合期间在形态学上演变成维管树几何形状61。d磁悬浮演示。通过磁悬浮，从不同浓度的细胞中提取的间充质干细胞(MSC)球体:(e) 6×103， (f) 1×104， (g) 2×104细胞/mL。图像显示，种子细胞浓度与球体大小有直接关系。标尺:10 μm。

低贴壁细胞培养平板法
使用低贴壁或亲水性处理的细胞培养板(图2d)也已实现。在这种方法中，用共价结合的中性亲水性水凝胶等试剂进一步处理板，这些试剂抑制细胞附着、蛋白质吸收和酶激活。这种处理导致镀的细胞聚集并形成球体。然而，对于某些特定的细胞类型，这种方法并不总是形成球体，这导致需要额外的步骤来形成所需的细胞聚集。与挂滴法类似，该方法执行简单，允许高吞吐量，并且与其他方法相比具有相对的成本效益。这种方法通常可以获得直径为370-400μm的球体。这些球体的显微镜分析可以加速抗癌药物的筛选，通过测量单个球体随时间的增长速度使用相衬成像。例如，在胶原气-液界面系统中，从上皮细胞和间充质基质细胞的混合物中获得了3D胃肠道培养物。该模型在超过60天的时间内增殖和分化，这使得肠道干细胞龛的微环境得以复制。

磁悬浮法
磁性悬浮(ML，图2e)是另一种生产类器官的方法。在这种方法中，细胞与噬菌体、多分散金纳米粒子和涂有水凝胶的磁性氧化铁纳米粒子(<50 nm)一起培养和孵育过夜。纳米颗粒被细胞吸收，细胞被胰蛋白酶化。一旦放置在一个低连接板，磁性盖子被放置在顶部。这个磁铁，反过来，吸引纳米粒子，并创造一个液体-空气电池悬浮液。细胞融合在一起并开始产生ECM蛋白。这种方法使球体生长速度更快，坏死和缺氧区域的复制更快，而且不需要特定的介质或支架。然而，纳米粒子价格昂贵，如果大量使用可能会对细胞产生毒性作用。无论如何，这种技术提供了更好的构造大小控制。例如(图4d-g)，将磁性纳米颗粒掺入间充质干细胞(MSCs)中，可以使用ML产生球形模型。该模型用于追踪单个MSCs在白细胞介素6的作用下在球体中的迁移，揭示单层培养中二维迁移和球体模型中三维迁移的机制差异。结合荧光标记的纳米颗粒可以使用荧光显微镜监测间充质干细胞的迁移。这些纳米颗粒主要存在于细胞质中，没有明显的细胞毒性。然而，目前尚不清楚纳米颗粒是否能引起细胞功能更细微的变化。

打印的方法
生物打印机最近在3D结构的制造中获得了很大的吸引力。虽然成本不低，但这项技术可以精确和通用地打印多种组件，包括ECM、细胞因子和细胞，从而改善微环境的复制。生物打印机的功能基于增材制造，即一层一层地沉积所需的材料，直到达到最终所需的结构复杂性。因此，生物打印机允许复杂组织的复制或原代细胞的沉积，然后可以进行组织发生形成有组织的生物结构。利用生物打印机，血管移植物、皮肤、骨骼和心脏组织以及细胞支架都已被制造出来。这种技术呈现出具有多种细胞类型和大规模生产能力的定制组织结构。也许生物打印的主要限制是具有所需特性和粘度的生物墨水的可用性，以及控制组织发育和功能。作为一个例子(图4c)， 3D生物打印被用于生成组织球体的血管树段，经过组织融合后，可以实现器官构建。此外，通过3D打印内皮细胞复合生物墨水构建类器官，然后添加心肌细胞。因此，使用这种3D生物打印方法，可以从多能干细胞中产生内皮化的人类心肌。在这项研究中，在生物打印支架上生长的心肌细胞表现出成熟心肌细胞的典型特征，如与收缩性相关的标志物的表达以及有组织的肌节。该方法生成的心脏组织在48 h后开始自发跳动。通过精确控制生物打印支架的物理特性，可以调节跳动的频率。这些类器官模型可以通过使用人类多能干细胞生成，这一事实可能为个性化药物筛选方法的发展铺平道路。

球体和类器官生产的挑战
模型的简单性
类器官和球体生产的挑战之一是难以重建体内细胞多样性，ECM和器官或肿瘤信号传导的复合物。例如，球状体可以建立微环境，使它们能够产生存在于组织中的表型。然而，球体通常由一种细胞类型组成，不能完全复制与其他细胞类型的复杂接触。此外，球状体可能不能完全再现在体内观察到的肿瘤遗传异质性。另一方面，类器官可以自我组装成复杂的体内结构，但它们通常缺乏血管化或血流、免疫细胞或基质的机械刺激。为了改进三维细胞模型，必须获得存在于体内的细胞多样性。例如，小胶质细胞是在大脑中发现的固有免疫细胞。然而，目前尚不清楚的是，目前的脑类器官在多大程度上结合了在大脑中观察到的小胶质细胞。然而，小胶质细胞在阿尔茨海默氏症等神经系统疾病中发挥着极其重要的作用，它们参与产生在疾病病理过程中至关重要的神经炎性因子。

营养和气体输送模型
类器官和球体的产生需要营养和氧合才能正常发育(图5a)。适当的血管形成和血管生成是肿瘤中营养和氧气输送所必需的，但在球体和类器官中很难在体外繁殖。例如，脑类器官模型可能需要几周才能形成完全成熟和功能齐全的神经元。这些3D脑模型的长期成熟和生长阻碍了有效的营养、气体和废物交换。目前的模型是由包裹在Matrigel内的胚状体(EBs)组成，并置于旋转生物反应器中的培养皿中形成类器官。然而，缺乏血管化限制了类器官向更成熟阶段的发展。这种限制是一个主要的缺点，特别是对于成人脑部疾病的类器官模型或涉及人类大脑体外衰老的研究。引入内皮血管和营养流动将有助于消除在这些模型中观察到的坏死，并使模型成熟为更大、更复杂的成人样脑。

图5: 常规和微流体类器官/球体生产方法的比较。

图表显示了(a)传统类器官和球体生产技术目前面临的挑战，包括缺乏适当的营养输送和交换，以及缺乏尺寸可重复性。b微制造和微流体为基础的方法允许阵列生产与改进的介质交换，以及由于一个确定的培养区域而改进的尺寸控制。

模型的可重复性
类器官和球体生产面临的最大挑战是无法控制尺寸以提高模型的可重复性(图5a)。缺乏可复制和标准化的模型是适度工程细胞微环境和ECM的结果。在没有物理和支架几何约束的情况下，控制这些模型的大小和细胞数量是具有挑战性的。模型之间的差异抑制了细胞结构的大规模生产，这对于精确的药物筛选研究等许多应用至关重要。

基于微加工的球体和类器官生产解决方案
微制造类器官是通过使用在微机电系统(MEMS)开发中实施的技术和方法产生的。这些技术在大规模生产中具有高通量和低成本的优点。两个有潜力改变类器官生产的领域是微图像学和微流体学。

缩微成像
典型的微图案方法包括诸如微接触印刷和软光刻方法的技术。微接触印刷通常涉及将ECM蛋白(如纤维连接蛋白和明胶)冲压到培养基质(如玻璃和聚苯乙烯)上。这些细胞外基质本质上变成了小的细胞粘附点。例如，图6显示了PMMA板如何被微铣削以形成PDMS印章的模具。然后使用PDMS印记在微磨PMMA孔的中心创建rgd -肽结合位点阵列(图6a)。将原代肝细胞植入孔中(图6a)，培养后2天内形成肝细胞球体(图6b)。图6c, d显示了培养7天后井内和流动井内1500个形成的球体阵列的一部分。球细胞分析用苏木精和伊红染色(图6e)显示，即使在直径约150μm的球体的核心处也有活力，而马松三色(图6f)染色在圆形球体内鉴定出胶原原纤维。微模式结构和胶原凝胶也被用于驱动肠上皮细胞自我更新为人类小肠类器官。使用标准光刻工艺制作的PDMS图章，圆形柱和相邻微孔的结构分别复制了通常在天然肠道中观察到的绒毛和隐窝结构。将胶原水凝胶微塑成高大的微柱结构，用生长因子(Wnt-3A、R-spondin 3和noggin)的化学梯度诱导人小肠细胞增殖，促进人小肠类器官的适当分化。在另一项研究中，人类ESCs被微图案化成微米大小的人层粘连蛋白521 (LN-521)岛，用BMP4处理后，在原肠胚中观察到的自组织模式和表达标记得以实现。不幸的是，如果冲压是一个手工过程，它往往导致再现性差，缺乏图案效率。然而，微接触打印的明显优势是它允许高通量平台。这种方法使得用96孔微滴板产生微接触印刷岛成为可能。

图6: 用于生成球体阵列的微图案化技术的示例示意图。

a将PMMA板材铣削成封头直径为100 μm的孔，制备微接触冲压件。这个磨板最终被用作邮票模具，在其上浇铸PDMS以生产微接触PDMS邮票。第二个PMMA板也被磨成直径300 μm，高度400 μm的井，连接流通道(宽100 μm，深100 μm)。然后将整个组件(也称为球形微阵列芯片)涂上一层铂薄膜，并通过在孔底部打印1mm RGD肽来使用PDMS图章来创建细胞附着区域。然后将该装置浸入5 mM PEG-SH乙醇中，以消除印刷RGD肽区域周围的非特异性细胞结合，从而产生球体。图像显示球形微阵列芯片与(b)原代肝细胞。培养2天内，(c)肝细胞球状体直径均匀。d培养7天后，孔内和(e)流型芯片内的肝细胞球形阵列图像。球体微阵列芯片生成的肝细胞球体横切面，培养3天后用(f)苏木精和伊红(g)和马松三色染色。

软光刻是另一种微图案方法，允许大规模生产，比手动微接触印刷更准确和可复制。然而，软光刻需要使用复杂而昂贵的设备，这些设备必须在洁净室设施等受控环境中进行维护。深紫外光(<200 nm)的光氧化PEG已成为高通量图图化的一种有吸引力的替代方法，并已应用于hPSC系的高含量筛选。此外，具有确定尺寸的微图案芯片的应用促进了具有可复制大小和形状的早期胚胎发育2D模型的生成。在这种方法中，通过将多能干细胞几何限制在盘状层粘胶蛋白包覆的芯片中产生胚胎样结构，并通过激活BMP信号诱导产生与胚胎胚层相对应的三个不同区域。这些二维胚胎样结构的几何限制通过微图案显着提高了生产方法的可重复性。

微流体
由于微环境被复制，微流体也对3D培养产生了影响;它允许营养和生长因子的持续注入。微流体技术还可以精确复制细胞-细胞接触，基质特性，生化和机械线索以及刺激。一个简单的基于微流体的三维细胞结构通常由一种细胞类型组成，但更复杂的结构有多种细胞类型的报道。这些基于多细胞微流体的设备也被称为器官芯片设备。由于微流控平台的小型化和阵列微加工方法，可以用于高通量生产。然而，由于可用的细胞数量少，进一步的细胞后分析可能很困难。器官芯片模型显示出很大的希望，因为它们可以诱导营养灌注并避免坏死。这种坏死抑制类器官的发育并促进类器官中心的细胞死亡。例如，基于微流体的脑类器官已被证明可以避免交错进展，因为它们可以在特定的细胞密度和核菌株下形成卷积。经过图像分析，研究人员能够推断出表面的褶皱和折叠是由于细胞骨架在中心收缩而细胞核在周围拉伸。微流控芯片可以复制一个微环境，在这个微环境中，Matrigel支架存在于一个有限的几何空间中，促进脑类器官的起皱结构，同时获得营养和废物交换。因此，这些微流控平台是异质组织复制的良好候选者，也是观察和研究大脑发育的生物和生物物理机制的良好候选者。一项研究显示，利用微流控芯片在体外生成脑类器官，ihPSCs自我更新形成胚状体，然后形成神经外胚层，最终形成类器官(图7a-c)。在该微流体装置中，胚状体与Matrigel混合，并通过微柱特征分隔的相邻通道向介质灌注(图7b)。基质可以适当地分散营养物质、气体和可溶性物质，促进干细胞分化，而流动介质则为培养提供必要的营养物质。图7d显示了3-33天培养期间产生的脑类器官。在这个微流控平台上，神经分化和皮层结构得以实现。这些类器官产生的皮质标记物水平增加，类似于体内皮质发育。该研究小组还发表了另一项研究，利用微流控芯片研究了尼古丁对胎儿大脑类器官发育的影响。该研究通过免疫组织化学染色在芯片内显示未成熟神经元分化和非典型脑发育切片。

图7: 用于脑类器官生产的微流体装置示例。

a hiPSCs体外脑类器官生成过程示意图。b用于衍生脑类器官的器官芯片微流控芯片示意图，其中胚状体由hiPSCs产生，并被Matrigel包裹。采用相邻灌注通道输注;这些条件允许胚状体分化和组织成脑类器官。c微流控芯片内脑类器官培养和分化过程描述。d培养第3、11、18、26、33天获得的类器官细胞图像。比例尺:100μm。

微流体的应用极大地促进了早期人类发育的类器官模型的产生，其规模是传统细胞培养方法无法实现的。利用微流体技术和人类胚胎干细胞，可以在体外以可扩展和可控的方式忠实地再现人类胚胎发育的最初几天。在另一项已发表的研究中，研究人员利用液滴微流体的高通量特性来产生肿瘤球体。利用由四个入口和一个出口组成的流动聚焦微流控装置，作者能够将MCF-7乳腺肿瘤细胞封装在核心中，并将基质成纤维细胞封装在海藻酸盐核-壳颗粒的外壳中。肿瘤核心结构和壳间质成纤维细胞重新填充肿瘤-间质微环境，为高通量药物筛选提供了一种方法。另一种器官芯片设备被用于制造3D人体小肠类器官。在该装置中，研究人员使用从肠道活检中提取的原代上皮细胞原位获得三维肠绒毛样结构。在微流控芯片内，有两个堆叠的腔室用作上皮和血管通道，由ECM涂层膜分开。来自外部培养的类器官片段在上皮通道内播种。通道的侧壁被制造和设计成模仿周期性的收缩和扩张，这复制了人类小肠的蠕动性质。细胞分析显示上皮细胞具有屏障功能和多系分化。此外，转录组分析显示，在芯片内培养的肠道结构比原始种子类器官更类似于体内的人类十二指肠。

微传感器集成
由于类器官发育需要长时间的培养，因此监测环境和生长过程至关重要。通过引入原位生化、光学和物理传感器来跟踪类器官的成熟，已经做出了努力。例如，研究人员开发了一个平台，其中包括微型生物反应器、气动阀、储存器、气泡捕集器、电化学和物理传感器。该平台被小型化，以适应台式孵化器，并用于监测肝脏和心脏类器官。电化学传感器被设计用于测量由类器官产生的可溶性标记物，其功能基于抗体-抗原结合过程中发生的氧化还原反应的电子转移。不同的抗体在电极上功能化，以识别和量化分泌的不同可溶性标记物。同时，采用物理传感器测量环境参数，如pH值、温度和氧合水平。在微生物反应器内，细胞被包裹在明胶甲基丙烯酰(GelMA)中，微图案被用来驱动球体的产生。这个模型是一个很好的例子，说明微流体和微传感器如何实现球体和类器官生成的自动化，以及在药物筛选和毒性方面应用的可能性。

成本效益
由于低通量技术和昂贵的试剂，类器官的生产可能很昂贵。在做成本分析时，简要地发现，通过传统方法，每个类器官的制造成本高达150美元。例如，使用微流控芯片在单个芯片中产生24个类器官所需的试剂体积减少了10倍，并且每个类器官批次的成本将降低到约1美元(表1)。

结论及未来发展方向
球体和类器官在改善生理相关细胞和肿瘤模型的复制方面具有很大的前景，这些模型揭示了生物学机制、发病机制和疾病治疗。这些模型不仅比二维细胞培养更接近体内组织，而且可以很容易地在培养皿中概括人类特异性生物学。虽然已经出现了几种球体和类器官生成技术，但目前的球体和类器官生产技术受到无法复制复杂的细胞-细胞相互作用、细胞多样性和体内组织微环境线索、缺乏营养和气体输送以及缺乏可重复性的限制。微基技术提供了有希望的解决方案，以解决目前面临的球体和类器官生成的几个问题。利用微图纹和微流控平台等技术，可以控制细胞结构的大小和形状。微技术解决方案可以提高球体和类器官的可重复性，它们可用于输送和交换营养物质，诱导剪切应力等机械信号，并允许通过使用传感器实时监测生长和环境参数。此外，微技术技术有助于大规模生产，这是药物测试和商业应用所必需的。虽然微技术解决方案已经允许球形和类器官的改进，但它们的全部潜力尚未得到满足。微技术辅助球体和类器官的未来将取决于多个类器官如何被整合到一个单一平台中，以重现在体内观察到的复杂细胞-细胞微环境。这种努力将需要仔细设计和优化室和介质。随着微技术方法变得更加精确，3D细胞培养模型也将变得更加精确。未来研究的另一个令人兴奋的领域是将来自不同组织的类器官组装成人体的功能单位，也称为类器官组装体，这将使我们能够在体外研究人体组织的相互联系。通过适当的精密设计和技术进步，球体和类器官平台将取代动物模型研究以及目前的体外模型在发病机制、生物学机制和药物筛选方面的应用是可行的。

参考文献：
Velasco, V., Shariati, S.A. & Esfandyarpour, R. Microtechnology-based methods for organoid models. Microsyst Nanoeng 6, 76 (2020). https://doi.org/10.1038/s41378-020-00185-3

相关应用介绍