沉默大脑神经元基因表达的siRNA脂质纳米颗粒递送
大脑中基因表达的操纵是理解神经元过程中蛋白质功能的基础。本文中,我们展示了一种使用脂质纳米颗粒(LNPs)中的小干扰RNA(siRNA)的方法,通过颅内注射在细胞培养和活体大脑中有效地沉默神经元基因表达。我们发现,神经元以一种载脂蛋白E依赖的方式积累这些LNPs,导致细胞培养中非常有效的摄取(100%),并且几乎没有明显的毒性。在活体内,皮质内或侧脑室(ICV)内siRNA-LNP注射导致靶基因在注射部位周围的离散区域或ICV注射后更广泛的区域被敲低,而LNPs没有明显的毒性或免疫反应。通过显示针对GRIN1(编码NMDA受体(NMDAR)的GluN1亚基)的皮质内siRNA传递,与突触AMPA受体电流相比,选择性地降低了活体内突触NMDAR电流,从而证明了有效的靶向敲低。因此,LNP递送的siRNA可以快速操纵体内神经元过程中涉及的蛋白质表达,可能使神经系统疾病的基因治疗得以发展。
自从发现RNA干扰是由双链RNA介导,使用小干扰RNA(siRNA)来沉默特定基因已成为一种强大的方法来操纵体外和体内的基因表达。然而,关于在体外和体内向神经元递送siRNA的问题限制了siRNA在哺乳动物神经科学研究中的广泛应用。短发夹RNA(shRNA)的病毒递送已经成功地在体内使用来敲低选择的目标,但必须考虑将shRNA包装成高滴度病毒的时间和费用,以及与病毒载体相关的毒理学和免疫学问题。在细胞培养中,由于使用脂质体技术观察到的低转染水平和毒性,使用siRNA方法在神经元中沉默基因仍然受到限制。转基因方法调节神经系统基因表达是耗时且昂贵的。反义寡核苷酸(ASOs)的稳定形式注射到大脑时可以有效,但需要注射大量的ASOs才能有效摄取。开发替代的递送方法,以促进siRNA在哺乳动物zhongshu神经系统中操纵基因表达,对神经科学家具有重要价值,并将加速我们对大脑功能的理解。
脂质纳米颗粒(LNPs)是目前外周细胞中siRNA治疗潜力的主要递送系统。在动物模型中,经过静脉注射(IV)的LNP-siRNA系统含有优化的阳离子脂质,可以沉默多种组织(特别是肝脏)5-7中的治疗相关基因。使用这些LNPs治疗心血管疾病、某些形式的淀粉样变和其他疾病的临床试验结果呈阳性(http://www.alnylam.com/Programs-and-Pipeline/Alnylam-5x15/index.php)。然而,LNP方法将siRNA递送至zhongshu神经系统神经元的疗效尚不清楚。由于LNP系统无法穿过血脑屏障,这些系统在脑组织中沉默基因的效力尚未被调查。在本文中,我们报告了在哪些条件下,LNP递送siRNA是一种非常有效的方法,可以在原代神经元培养和颅内注射后在体内沉默神经元基因表达。
在LNPs中封装siRNA
LNPs是通过使用微流控微混合器将适当体积的乙醇中脂质混合物与含有siRNA双链的水相混合而制备的(图1a)。所使用的脂质组成为3-(二甲基氨基)丙基(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-十八碳9,12-二烯-1-基]己二酸-12,15-二烯酸酯(DMAP-BLP)(结构见图1b)/二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)/胆固醇/PEG-DMG,摩尔百分比为50/10/37.5/1.5。LNPs还含有1 mol%荧光标记脂质DiOC18或DiIC18,以监测LNP摄取。先前的研究表明,具有这种脂质组成的LNP系统可以在静脉注射后以低至0.01mg siRNA/kg体重的剂量水平以载脂蛋白E(ApoE)依赖的方式沉默肝细胞中的靶基因。所产生的LNP磷酸酶和张力蛋白同源物1(PTEN)-siRNA系统直径为55±11nm(尺寸分布见图1c)。
图1,采用交错人字形微搅拌器LNP-siRNA制备工艺示意图。(a)乙醇中的脂质混合物和水溶液中的siRNA分别被注射泵以总流量2 ml/min泵入微流体混合装置的两个入口。人字形结构诱导层流的混沌对流,导致乙醇和水相的快速混合,并相应地使脂质溶液的极性迅速增加。在临界极性下沉淀形成LNPs。混合通道的尺寸为200×79 μm,人字形结构为31 μm高和50 μm厚。根据参考文献修改。(b)可电离阳离子脂质-3-(二甲氨基)丙基(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基]己二酸-12,15-二烯酸酯(DMAP-BLP)的化学结构。(c)使用NICOMP 370亚微米颗粒分级仪在数字模式下分析LNPs(LNP PTEN-siRNA)的代表性粒径分布。LNP,脂质纳米颗粒;siRNA,小干扰RNA。
图2,LNP-siRNA系统介导神经元培养中靶基因的敲低。(a) 在带有单独星形胶质细胞饲养层的培养皿盖子上的纯神经元培养。直接向培养基中加入LNP-siRNA。(b) DiI荧光(红色)显示LNPs存在于神经元的细胞质中。底部:荧光图像堆叠的横截面分析和透射红外图像显示,DiI点在细胞膜的边界内。比例:15 μm。(c) LDH释放量化显示,在所用浓度下LNPs无毒性。(d) 与luc siRNA-LNP对照和未处理的培养物相比,Western印迹显示LNP-PTEN siRNA导致PTEN蛋白质的敲低。(e) LNP-siRNA浓度对PTEN敲低的剂量反应,Z后一列显示未包封的siRNA未导致蛋白质的敲低。在所有图中,实验值均为均值和SEM。LDH,乳酸脱氢酶;LNP,脂质纳米颗粒;NS,不显著;siRNA,小干扰RNA。
图3,脂质纳米颗粒(LNPs)以载脂蛋白E(ApoE)依赖性方式被神经元摄取。(a,b)在星形胶质细胞缺失的情况下,添加ApoE促进神经元摄取LNPs,表现为DiI荧光的增加。处理:1小时LNP-siRNA ± ApoE。比例:100 μm。(c)LNP摄取量与ApoE浓度的剂量依赖性,以DiI荧光测定。在所有图中,实验值均为均值和SEM。***P < 0.001。DAPI,4',6-二<unk>基-2-苯基吲哚;NS,不显著;siRNA,小干扰RNA。
图4,LNP-siRNA系统介导体内靶基因的敲低。(a)使用玻璃微量移液器将LNP-siRNA直接注入体感皮质。(b)单次注射LNP-siRNA后5天急性脑片成像显示活的神经元(AM染料)已摄取荧光LNPs(DiI)(c,d)Western blots显示注射LNP-PTEN siRNA与未注射半球和luc siRNA-LNP注射大鼠的组织相比,导致PTEN蛋白的敲低。5天后从注射部位1mm内解剖组织。(e)分析用钙黄素-AM染色活细胞的密度显示,体内摄取LNP(200-500 μm)没有毒性或细胞损失的迹象。(f)从luc siRNA-LNPs处理的急性脑片中测定的TNF-α ELISA显示脑组织对LNP缺乏免疫刺激反应。阳性对照,LPS处理的片显示TNF-α增加。(g)从LNP阳性组织(注射处100-500 μm)测定的TNF-α ELISA与LNP阴性的未注射半球无显著差异。测量结果标准化为0.5 mg蛋白质。*P < 0.05;***P < 0.001。ELISA,酶联免疫吸附测定;LNP,脂质纳米颗粒;LPS,脂多糖;NS,不显著;siRNA,小干扰RNA;TNF-α,肿瘤坏死因子-α。
图5,体内蛋白质敲低的距离分布和时间进程。(a) 在距离LNP-siRNA注射部位不到1mm的神经元中,PTEN蛋白的免疫荧光降低。图示蒙太奇是从注射通道后方的剖面获得的,星号表示距离注射400μm的点。(b) 一个示例的Western blot(插入)显示在距离注射通道不到1mm的组织中PTEN蛋白降低。柱状图显示了在邻近LNP-siRNA注射部位不同距离解剖的组织上的Western blot的汇总数据。(c) Western blot显示在单次颅内注射LNP-siRNA后5、10和15天时PTEN的持续敲低。*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001。LNP,脂质纳米颗粒;NS,不显著;siRNA,小干扰RNA。
图6,脂质纳米颗粒(LNPs)经侧脑室注射后能够广泛分布和敲低。(a)海马CA1区DiI荧光显示细胞体层(sp)神经元对LNPs的摄取。 尺度:25 μm。(b-d)Western印迹显示经侧脑室注射siRNA-LNPs导致不同脑区(背侧海马和纹状体)靶蛋白(PTEN)的敲低。*P < 0.05;**P < 0.01。siRNA,小干扰RNA; so,东方层; sp,锥体层(细胞体层); sr,辐射层。
参考文献:
Rungta RL, Choi HB, Lin PJ, et al. 2013 Dec 3;2(12):e136.
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